取卵后立即凍胚移植患者血清E2、P、VEGF水平與妊娠結局的相關性

張秀芬 趙建峰

新鮮胚胎移植后未孕以及全胚冷凍的患者，為了讓機體功能得以恢復，通常建議患者取卵后2～3個月以后行首次凍融胚胎移植，延遲移植時間可能會增加不孕夫婦的壓力及焦慮。凍融胚胎移植(frozen thawed embryo transfer,FET)作為不孕癥的有效治療手段，可以預防卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)，減少超促排卵及取卵的創(chuàng)傷，增加周期累計妊娠率，不僅減少了患者的經濟支出，而且提高了輔助生殖技術治療的安全性。FET前需要一定的方案準備子宮內膜，臨床上采用較多的FET子宮內膜準備方案是自然周期和激素替代周期。正常自然月經周期受孕，胚胎著床一般開始于月經第19天，持續(xù)4～5 d，即月經第19～24天，適合胚胎著床，臨床上稱為“種植窗”(window of implantation，WOI)[1]；雌激素促使子宮內膜上皮細胞和腺體增生，孕激素受體的合成也需要適量的雌激素，在此基礎上，孕激素促進內膜上皮細胞分泌糖原等營養(yǎng)物質，間質蛻膜樣變，子宮內膜血流進一步豐富，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是主要的血管生成因子，可以促進子宮內膜及其血管的生長，多種因子共同調節(jié)子宮內膜容受狀態(tài)，為胚胎著床和早期胚胎發(fā)育提供必需的物質基礎，開啟“種植窗”。基于臨床工作的需求，探討取卵后1～2個月行首次FET，不同子宮內膜準備方案妊是否和娠結局相關，在FET過程中，監(jiān)測血清雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)及VEGF水平能否預測妊娠的結局。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取滄州市人民醫(yī)院生殖科2020年1～12月接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的不孕癥患者，獲本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 標準

1.2.1 診斷標準：未避孕、有正常性生活至少12個月而未孕，稱為不孕癥。

1.2.2 入組標準: ①年齡20～40歲；②凍存至少1枚優(yōu)質胚胎，D3卵裂期優(yōu)質胚胎,卵裂球數(shù)6～9個，胞質均勻，形態(tài)規(guī)則，碎片<10%,優(yōu)質囊胚評分≥3BB；③IVF-ET治療指征為輸卵管因素或男性因素；④采用拮抗劑方案或者卵泡期長方案促排卵；⑤取卵后第一次FET。

1.2.3 排除標準： ①子宮畸形、子宮內膜異位癥、宮腔粘連；②合并免疫性疾病；③反復種植失敗者；④年齡>40歲。

1.3 方法

1.3.1 對應取卵周期超促排卵方案

1.3.1.1 拮抗劑方案：于患者月經第1～3天檢測驗血性激素水平，行陰道B超檢查，評估一般情況及卵巢功能，予促性腺激素(Gn)100～300 U啟動，每2～5天根據(jù)陰道B超測量卵泡徑線及血清性激素水平變化調整Gn劑量。優(yōu)勢卵泡直徑>12 mm和血清(E2)>300 ng/L時起(或者在使用Gn第6天起)[2]，加用促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant) 0.25 mg/d，至扳機日，當≥2個卵泡的平均直徑≥18 mm時，給予促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)0.2 mg、人絨毛膜促性腺激素(HCG)6 000～10 000 U扳機，促進卵泡進一步發(fā)育成熟，間隔36 h行陰道B超引導下穿刺取卵，當日行IVF/ICSI。

1.3.1.2 卵泡期長方案：于月經第1～3天給予長效促性腺激素釋放激素類似物(GnRH-a)進行垂體降調節(jié)，需28～39 d，達到降調節(jié)標準[3](FSH<5 U/L、LH<5 U/L)、子宮內膜<5 mm、卵泡直徑≤5 mm、血清E2<183.5 pmol/L后給予Gn 150～300 U啟動，每2～5天根據(jù)陰道B超測量卵泡徑線及血性激素水平變化調整Gn劑量。當有≥2個卵泡的平均直徑≥18 mm時，使用HCG 6 000～10 000 U扳機，促進卵泡進一步發(fā)育成熟，間隔36 h行陰道B超引導下穿刺取卵，當日行IVF/ICSI。

1.3.2 根據(jù)準備子宮內膜周期方案分組：共納入首次解凍移植病例174例，其中135個周期為新鮮周期未移植，因預防OHSS或者子宮內膜容受性差等原因行全胚冷凍,其余39個周期為鮮胚移植后未孕或流產。自然周期(A組)54例，平均年齡(31.09±3.52)歲；激素替代周期(B組)64例，平均年齡(31.15±4.15)歲；晚刺激周期(C組)56例，平均年齡(30.14±4.59)歲。月經第1～3天行基礎內分泌檢測，陰道B超檢查排除子宮及卵巢異常情況。

1.3.3 胚胎來源及解凍

1.3.3.1 對應卵巢刺激方案 主要包括卵泡期長方案、拮抗劑方案，IVF-ET均按本中心常規(guī)進行。取卵后第3天(卵裂期胚胎) 或第 5～6天(囊胚)達到冷凍標準的胚胎進行凍存。

1.3.3.2 胚胎分級解凍 卵裂期胚胎分級標準為：Ⅰ級胚胎為卵裂球大小均勻，無或僅有極少(<10%)碎片；Ⅱ級胚胎為卵裂球大小稍不均勻，碎片率10%～20%；Ⅲ級胚胎：卵裂球大小明顯不均勻，碎片率21%～50%；Ⅳ級胚胎：卵裂球大小很不均勻，碎片率≥50%。采用玻璃化冷凍和解凍程序(均采用日本加藤公司解凍試劑)。

1.3.4 子宮內膜準備方案

1.3.4.1 A組：月經第10～12日有卵泡自然生長，必要時檢測血LH、E2、P[4]，監(jiān)測到卵泡發(fā)育成熟并排卵，排卵后給予黃體酮20 mg，肌內注射，1次/d。排卵后第3天移植卵裂期胚胎。移植后黃體支持，給予黃體酮20 mg，肌內注射，1次/d；地屈孕酮10 mg，口服，2次/d。

1.3.4.2 B組：月經周期第3天起口服戊酸雌二醇片4 mg/d，B超監(jiān)測子宮內膜，根據(jù)內膜生長情況調整激素用量(口服戊酸雌二醇最多加至9 mg/d；口服芬嗎通紅片最多加至8 mg/d)，雌激素補充至少12 d，若子宮內膜厚度仍<6 mm，加用芬嗎通白片(內含雌二醇 1 mg/片)1～2 mg，(1次/d)，陰道給藥至內膜轉化日。內膜厚度≥8 mm時，加用肌內注射黃體酮60 mg，(1次/d)；在給黃體酮第4天行凍融胚胎移植，移植后加用地屈孕酮10 mg，口服，3次/d，并繼續(xù)予戊酸雌二醇口服和黃體酮肌內注射。

1.3.4.3 C組：月經第10～12日[5]陰道B超未觀測到優(yōu)勢卵泡生長，給予尿促性素75～150 U,肌內注射,1次/d，促使卵泡生長發(fā)育，必要時檢測血LH、E2、P，監(jiān)測到卵泡發(fā)育成熟并排卵，移植時間及移植后黃體支持同自然周期。

1.4 妊娠結局的判斷標準 (1)生化妊娠：胚胎移植后12～14 d化驗血清β-HCG≥25 U/ml，陰道超聲未見孕囊前HCG值逐漸下降提示生化妊娠；(2)臨床妊娠：胚胎移植4周后通過陰道B超檢查觀察到孕囊及原始心血管搏動；(3)異位妊娠：移植后30～35 d通過陰道B超檢查宮腔內未探及孕囊，附件區(qū)探及孕囊或包塊回聲為異位妊娠;(4)早期流產：孕12周前流產診斷為早期流產；(5)活產：有胎兒活產(包括早產)者為活產周期。

1.5 觀察指標及妊娠結局判斷[6]:在子宮內膜轉化前(A組、C組均于排卵日，B組于P給藥前)和胚胎移植前一天檢測血清E2、P以及VEGF水平；胚胎移植后12～14 d根據(jù)血β-hCG值確定為生化妊娠，是否臨床妊娠需移植后4周根據(jù)超聲檢查確定。臨床妊娠率=移植后臨床妊娠患者數(shù)/凍融胚胎移植患者數(shù)×100%，著床率=超聲可見孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%，異位妊娠率=移植后異位妊娠患者數(shù)/臨床妊娠患者數(shù)×100%；早期流產率=移植后自然流產患者數(shù)(<妊娠12周)/臨床妊娠患者數(shù)×100%；活產率=活產周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。分組計算以上指標，并將數(shù)據(jù)進行比較。

2 結果

2.1 患者進入周期前一般情況及FSH、LH、E2比較 3組年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、卵巢基礎狀態(tài)等均符合正態(tài)分布，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組患者一般情況及基礎性激素水平比較

2.2 3組子宮內膜轉化日子宮內膜比較 A組子宮內膜厚度為9.5(8.68，11.33)mm，38例為A型內膜，16例為B型內膜；B組子宮內膜厚度為9.15(8.50，9.70)mm,45例為A型內膜,19例為B型內膜；C組子宮內膜厚度為9.35(8.83，11.78)mm,43例為A型內膜,13例為B型內膜；子宮內膜厚度在A組和B組(P=0.026)、C組和B組(P=0.016)比較均有差異， A組和C組子宮內膜厚度比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.645)。

2.3 3組子宮內膜轉化前后血E2、P、VEGF水平比較

2.3.1 子宮內膜轉化前:血E2值A組和C組(P=0.000)B組和C組(P=0.000)比較有差異，A組和B組比較無差異(P=0.387)；血清P值A組和B組(P=0.000)，A組和C組(P=0.001)，B組和C組(P=0.000)比較差異均有統(tǒng)計學意義；3組間血VEGF水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3.2 子宮內膜轉化后:血E2水平A組和B組有差異(P=0.001)，B組和C組間(P=0.156)、A組和C組間(P=0.052)無差異；血P和VEGF水平3組間比較無差異(P>0.05)。見表2。

表2 3組子宮內膜轉化前后血E2、P、VEGF水平比較

2.4 妊娠者和未妊娠者子宮內膜轉化前后血清E2、P、VEGF比較 將174例患者按是否臨床妊娠分為妊娠者(n=97)和未妊娠者(n=77)2組，子宮內膜轉化前后E2、P、VEGF水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 妊娠者和未妊娠者血清E2、P、VEGF比較

2.5 FET后臨床妊娠率、著床率、早期流產率、異位妊娠率及活產率比較 3組患者的臨床妊娠率、著床率、活產率及異位妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。B組患者的早期流產率較高，與A組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.172)；B與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028)，A組與C組間無差異(P=0.368)。見表4。

表4 3組患者妊娠結局的比較 %(例)

3 討論

3.1 不同內膜準備方案對子宮內膜厚度的影響 有研究顯示：相比于激素替代周期，自然周期內膜厚度較高[7，8]；另有研究則認為：降調節(jié)+激素替代周期子宮內膜厚度更高[9，10]。我們的數(shù)據(jù)顯示子宮內膜厚度自然周期和晚刺激周期均高于HRT周期，可能因為自然周期和晚刺激周期均為長卵周期，尤其晚刺激方案在卵泡自然生長的基礎上加用一些藥物刺激卵泡生長，內膜轉化前E2水平較高，而且在卵泡生長過程中除了雌、孕激素可能還會產生其他因子，輔助刺激了子宮內膜的增長及轉化，更有利于增加子宮內膜的厚度。對于以往內膜偏薄的患者可考慮根據(jù)情況采用自然周期或者晚刺激周期準備內膜。關于FET周期的一項研究顯示，子宮內膜厚度<6 mm與活產率顯著降低明顯相關，在7～10 mm后活產率趨于穩(wěn)定[11], Shaodi等[12]認為在HRT-FET周期中，當子宮內膜厚度保持在8.7～14.5 mm時，可獲得最佳活產率。

3.2 子宮內膜準備方案與妊娠結局 一項分析表明各種子宮內膜準備方案的妊娠率無顯著差異[13]；關于妊娠結局的報道各異，有研究認為改良自然周期具有更高的活產率[14]；Peigné 等[15]研究認為促排卵周期比激素替代周期有更高的活產率；一項多中心的試驗表明：自然周期以及激素替代周期方案準備內膜活產率、持續(xù)妊娠率等結局方面并沒有差異[16]； Yarali等[17]的研究表明：自然周期臨床妊娠率高于沒有降調的激素替代周期，但活產率沒有差別，而降調節(jié)后激素替代周期活產率高于自然周期，沒有發(fā)現(xiàn)一種內膜準備方案，保持始終如一的優(yōu)勢。以上研究結果并沒有特意提到FET是發(fā)生在取卵后多長時間，我們的研究是在取卵后第1～2個月即行FET, 結果是自然周期、激素替代周期、晚刺激周期3種內膜準備方案臨床妊娠率無差異；激素替代周期和自然周期比較早期流產率無差別；數(shù)據(jù)表明：激素替代周期的早期流產率高于晚刺激周期，晚刺激周期使用HMG刺激卵泡生長的過程中或許產生的物質對于黃體的發(fā)育起了作用，更利于維持繼續(xù)妊娠。對于以前激素替代周期內膜反應不良的患者采用HMG治療，董曦等[18]研究表明：臨床妊娠率HMG組顯著高于HRT組,而流產率HMG組顯著低于HRT組。晚刺激方案相比于促排卵周期，不易發(fā)生卵巢過度刺激，相比于激素替代周期子宮內膜厚度平均值較高，晚刺激方案的應用也減少了自然周期卵泡不能生長的機會，降低自然周期取消率。

3.3 子宮內膜轉化前后E2、P、VEGF水平的變化

3.3.1 FET前E2水平：有研究發(fā)現(xiàn)： HRT-FET周期E2值(100～500 pg/ml)妊娠率相似,當E2水平<100 pg/ml或>500 pg/ml時，流產率顯著增加，過高或過低的雌激素水平可能都會影響胚胎種植[19]。Zhou等[20]的研究認為P給藥前血清E2水平升高與凍融囊胚移植后活產率降低有關；另外有研究認為HRT-FET周期內膜轉化前血清高E2水平不影響妊娠結局[21]，冷凍胚胎移植周期的持續(xù)妊娠率不受E2水平升高的負面影響。我們的結果分析：3組患者在子宮內膜轉化前E2值有差異，轉化后血清E2水平在HRT周期最高，但是3組的臨床妊娠率無差異，妊娠者和未妊娠者內膜轉化前后E2水平并無差異，更是證明了E2并不是劑量依賴的，更可能是起允許作用，水平高低并不能影響臨床妊娠率。

3.3.2 FET前P水平:盡管P監(jiān)測通常不在常規(guī)臨床實踐中進行，有研究數(shù)據(jù)顯示血清P濃度與活產率亦相關，胚胎移植日平均血清P為11.4 ng/ml，血清P<10 ng/ml，妊娠率顯著降低(P=0.04)，活產率降低(P=0.01)[22]。另有研究認為：FET當天的血清P水平≥10 ng/ml，不會顯著改善妊娠結局，P<5 ng/mg與低活產率相關，表明P存在一個閾值，低于該閾值很難挽救FET周期妊娠結局[23]。我們的數(shù)據(jù)內膜轉化前P水平在晚刺激周期最高，進一步分析內膜轉化前后血清P水平在妊娠者和未妊娠者之間并沒有差別，可能內膜轉化后黃體支持比較充分，P水平普遍較高，恰都在閾值之上，高水平的P對妊娠率及妊娠結局就已不具有預測作用，因此對于充分黃體支持的患者，沒有必要監(jiān)測血清P水平。

3.3.3 FET前VEGF水平：Law等[24]研究表明在胚胎移植后成功受孕的女性中，VEGF在內膜基質表達高于胚胎移植后未受孕的女性。另有研究表明：與對照組相比，反復移植失敗組外周血VEGF水平顯著降低[25]；我們的數(shù)據(jù)顯示內膜轉化后血VEGF水平均高于轉化之前，內膜轉化前后妊娠者和非妊娠者血清VEGF濃度沒有顯著差異。