Wnt5a基因慢病毒的構建與RSC96雪旺細胞的感染研究*

韋良臣，楊 琪，曾 暉，翁 鑒，劉 佩，康 斌，鐘華戈，于 斐△

(1.北京大學深圳醫院骨關節科，廣東 深圳 518036；2.骨科生物材料國家地方聯合工程研究中心，廣東 深圳 518036；3.北京大學深圳醫院超聲診斷科，廣東 深圳 518036；4.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院胃腸外科，廣西 南寧 530021)

周圍神經損傷是指周圍神經干及其分支受到直接或間接創傷后發生的損傷，常見于體力勞動者，致傷原因包括解剖性原因和損傷性原因。解剖性原因是解剖異常引起周圍神經的卡壓性損傷；損傷性原因主要由于機械性原因(切割、擠壓)、物理性原因(凍傷、燙傷)、缺血性原因(栓塞)、醫源性原因(注射、手術)及代謝、腫瘤等造成[1]，可導致軀體的運動、感覺及自主神經功能障礙等一系列癥狀。周圍神經損傷的治療效果常難以估計，受到損傷部位、損傷原因、機體狀況等多種因素影響，若治療不及時，往往會導致不良后果，嚴重者甚至會導致殘疾，這使得周圍神經損傷成為骨科醫生的棘手問題。周圍神經損傷可通過藥物、電刺激等非手術方法和手術方法治療[2]。隨著醫學發展，越來越多的神經相關因子被證實與周圍神經損傷修復相關，例如傳統的神經生長因子、睫狀神經生長因子、轉化生長因子等[3]，均可促進周圍神經損傷后的修復。許多新的因子也能有效實現功能，例如Wnt5a因子[4]。

Wnt5a因子是非經典Wnt信號通路的代表性配體，首先于20世紀90年代被發現，其基因含有5個外顯子，起始的631 bp有很強的啟動子活性[5]。研究顯示，Wnt5a因子可以通過自身所在的非經典Wnt信號通路、核因子-κB(NF-κB)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等[6]，參與到骨科相關疾病如周圍神經損傷、骨關節炎、骨缺損修復等[7]的進程中。雪旺細胞是周圍神經系統中的神經膠質細胞，延神經元的突起分布，包裹在神經纖維上形成有髓神經纖維，是周圍神經疾病中研究較多的一種細胞。RSC96細胞是一種細胞系，經大鼠原代培養的雪旺細胞長時間培養后自發轉化而形成，呈貼壁樣生長，能夠表達原代雪旺細胞的部分特性，常常用于周圍神經損傷相關的疾病研究中，以代替原代雪旺細胞。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎發展起來的一種病毒載體，對多種細胞均具有感染能力，被廣泛應用于表達RNAi的動物及細胞實驗中。該病毒可以將外源性基因穩定地整合到宿主細胞的染色體上，從而形成可以傳代且表達穩定的外源性基因子代細胞，與只能實現瞬轉的逆轉錄病毒載體比較有較大優勢，也較多地被應用于骨科相關研究中[8]。目前，少見學者對RSC96雪旺細胞中應用Wnt5a基因慢病毒進行感染的細胞模型進行報道。本研究中，作者構建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，用其感染RSC96雪旺細胞，觀察慢病毒感染情況，檢測細胞中Wnt5a mRNA的表達情況，從而建立相關細胞模型，為骨科研究周圍神經損傷等相關疾病提供方法學基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 RSC96雪旺細胞系(中國科學院上海細胞庫)；293T細胞(上海細胞所)；Top10感受態細胞(Genechem公司)。

1.1.2主要試劑 人類免疫缺陷病毒(HIV)-1 p24 Antigen 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 2.0試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)；蘇木素、伊紅(北京益利精細化學品有限公司)；Bulge-LoopTMmiRNA 定量聚合酶鏈反應(qPCR) Primer試劑盒(廣州銳博公司)；Trizol(上海普飛公司)；oligo dT(上海生工公司)；嘌呤霉素(Clontech公司、Sigma公司)；NormalRunTM250 bp-Ⅱ DNA Ladder(GeneRay公司)；限制性核酸內切酶(NEB公司)；dNTPs、M-MLV試劑盒、RNA酶抑制劑(Promega公司)；SYBR Master Mixture(TaKaRa公司)；GeneRuler 1 kb DNA Ladder、T4 DNA連接酶(Thermo Scientific公司)；Taq Plus DNA聚合酶(Vazmye公司)。

1.1.3主要儀器 普通光學顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)；倒置顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)；數顯式穩壓穩流電泳儀、凝膠成像儀(上海天能公司)；Blue Pard隔水式恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；生物安全柜(上海振樣創空氣凈化設備有限公司)；超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司、Thermo Scientific公司)；熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；聚合酶鏈反應(PCR)儀(Applied Biosystems 公司)；反轉錄耗材(Axygen公司)；超速離心機(Beckman Coulter公司、Eppendorf公司)；移液器(Eppendorf公司、吉爾森有限公司)；超細勻漿機(FLUKO公司)；細菌搖床(華利達實驗設備公司)；測序儀(美季生物公司)；細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific公司、SANYO公司)；Celigo(Nexcelom公司)；Real time PCR儀器(Roche公司)；高速離心機、Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1RSC96雪旺細胞的HE染色 取適宜量的RSC96雪旺細胞接種于3 cm培養皿，待細胞接近長滿進行染色；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗5 min，2次；4%多聚甲醛固定60 min；PBS沖洗5 min，2次；蘇木素浸染3 min，水洗；伊紅浸染1 min，水洗；普通光學顯微鏡下拍照。

1.2.2Wnt5a基因慢病毒載體構建 根據大鼠Wnt5a基因序列設計一條Wnt5a-RNAi靶點序列GGG TGA TGC AAA TAG GCA G，其中GC含量為52.63%，起始位點為614。采用吉凱基因GV248載體構建Wnt5a基因慢病毒框架-a和Wnt5a基因慢病毒框架-b，見表1。引入AgeI和EcoRI作為酶切位點酶切載體，合成單鏈引物后退火形成雙鏈DNA，后用DNA連接酶將雙鏈DNA與酶切后的載體連接，轉化感受態細胞后挑選陽性克隆的菌落進行PCR鑒定(見表2)，測序測通后抽提合格質粒進行后續實驗。

表1 Wnt5a基因慢病毒框架

表2 陽性克隆PCR鑒定引物

1.2.3Wnt5a基因慢病毒包裝 取293T細胞。離心管中加入含有GV載體質粒20 μg、pHelp1.0載體質粒15 μg、pHelp2.0載體質粒10 μg的各DNA溶液，并與吉凱轉染試劑混合調節成1 mL，室溫溫育15 min。細胞與溫育后的液體混勻，37 ℃及CO2培養箱內培養6 h；PBS洗滌后用10%胎牛血清(FBS)再次于培養箱內培養2～3 d；上清液于4 000 g及4 ℃條件下離心10 min；濾器過濾后在25 000 r/min及4 ℃條件下離心2 h；棄上清液后用病毒保存液重懸離心沉淀物；10 000 r/min條件下離心5 min分裝保存備用。

1.2.4Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細胞 采用適宜量的RSC96雪旺細胞鋪12孔板，細胞密度為20%時用Wnt5a基因慢病毒進行感染，重復感染3次，每次感染3個復孔，感染復數(MOI)為10，感染條件為Eni.S，感染16 h換液，感染72 h進行觀察。

1.2.5感染后RSC96雪旺細胞中Wnt5a mRNA含量檢測 以GAPDH為內參(表3)，按照各目的基因退火溫度選擇二步法完成擴增，通過熔解曲線判斷擴增產物特異性，用2-ΔΔCt法進行數據分析。

表3 Wnt5a及GAPDH引物

2 結 果

2.1測序測通結果 根據測序可見，ccg gca GGG TGA TGC AAA TAG GCA Gct cga gCT GCC TAT TTG CAT CAC CCt gtt ttt g可測通。

2.2構建及鑒定Wnt5a基因慢病毒載體 陽性克隆片段及空載體克隆片段在PCR電泳圖中可以清晰看到，見圖1。

1為陰性對照(加入ddH2O)；2為陰性對照(空載自連對照)；3為Marker(自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp)；4～8為Wnt5a基因慢病毒轉化子鑒定。

2.3包裝Wnt5a基因慢病毒并進行滴度鑒定 重組的Wnt5a基因慢病毒質粒感染293T細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察可以看到感染后的293T細胞表達綠色熒光，表示病毒包裝成功(圖2)。

A～H為明場圖片；I～P為熒光場圖片；A～H及I～P的慢病毒量分別為10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6 μL。

2.4RSC96雪旺細胞的形態學觀察 普通光鏡下觀察，可以看到RSC96雪旺細胞貼壁后呈梭形、三角形或多角形，細胞擁擠處呈鋪路石樣外觀(圖3A)；蘇木-伊紅(HE)染色后可以看到，RSC96雪旺細胞的細胞核呈較深的粉紅色或紫色，形態主要為圓形；RSC96雪旺細胞的細胞質呈較淺的粉紅色或紫色，形態與光鏡下觀察類似，呈梭形、三角形或多角形(圖3B)。

A為普通光鏡下觀察；B為HE染色后觀察。

2.5Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細胞 用滴度為109TU/mL的Wnt5a基因慢病毒感染12孔板中生長密度為20%的RSC96雪旺細胞，MOI為10，感染后在Celigo細胞成像分析儀下觀察可以看到，感染后的RSC96雪旺細胞表達綠色熒光，并且可以看到細胞的狀態較好，沒有污染，見圖4。

2.6感染后RSC96雪旺細胞中Wnt5a基因mRNA表達情況 分別用Wnt5a基因慢病毒感染3次RSC96雪旺細胞，RSC96雪旺細胞中Wnt5a mRNA的表達量分別為0.211±0.028、0.259±0.027、0.148±0.005，平均表達量為0.206±0.056。

A為明視野下的RSC96雪旺細胞；B為熒光視野下的RSC96雪旺細胞。

3 討 論

Wnt基因最早于1982年的乳腺癌相關研究中被發現，被學者命名為Int1基因。之后，學者在果蠅的相關研究中發現了與Int基因高度同源的無翅基因(Wingless)，后將兩者合稱為Wnt基因[9]。由Wnt基因調控的通路即為Wnt信號通路，該通路可分為經典的Wnt/β-catenin信號通路和非經典的Wnt/PCP信號通路、Wnt/Ca2+信號通路。其中，Wnt5a主要屬于非經典的Wnt信號通路。Wnt5a基因定位于染色體3p14.2-p21.1區，人的Wnt5a蛋白與鼠99%同源[10]。Wnt5a基因在細胞增殖、內環境穩態維持、器官發育中具有重要作用，并可以通過PTEN、MAPK、NF-κB等信號通路影響周圍神經、中樞神經損傷修復或功能重塑[4]。周圍神經損傷是臨床上的棘手問題，尤其是損傷嚴重及大段缺損條件下，由于周圍神經損傷及修復機制不明確，臨床無法對其有效干預。雪旺細胞是周圍神經中非常重要的神經膠質細胞，對周圍神經損傷修復機制的研究意義重大。RSC96細胞是一種能夠多次傳代并表達雪旺細胞特性的大鼠來源細胞系，可以部分代替原代雪旺細胞用于周圍神經損傷修復的研究。

研究證實，Wnt5a基因可以通過調控雪旺細胞的功能，進而影響周圍神經的損傷修復。PAN等[11]發現，Long non-coding RNA NONMMUG014387可以通過靶向激活Wnt/PCP通路,促進損傷部位周圍雪旺細胞的增殖，這一過程中Wnt5a蛋白的表達量明顯升高，其可能影響了雪旺細胞的去分化和增殖，在周圍神經再生中起重要作用。SHARMA等[12]認為，Wnt5a在自體骨髓間充質干細胞分化為雪旺細胞的過程中發揮作用，從而在一定程度上提高了周圍神經損傷修復及神經元軸突再生的臨床細胞生物利用度。TIONG等[13]則認為，褪黑素可以通過Wnt信號通路中的Wnt5a因子，影響糖尿病周圍神經病變中雪旺細胞的凋亡。SIMONETTI等[14]通過動物模型證實，阻斷脊髓背根神經元Wnt5a-Ryk/Ror2軸可阻止活動依賴性樹突棘重塑，顯著降低外周損傷和炎癥引起的機械性超敏反應，從側面證實了Wnt5a基因在周圍神經損傷修復中的作用。

慢病毒是在HIV基礎上發展起來的一種病毒載體，對分裂及非分裂的細胞均具有較強的感染力。本研究團隊早期利用SIRT1基因慢病毒感染了ATDC5軟骨細胞，以及利用PTEN基因慢病毒感染了RSC96雪旺細胞[15-16]，并發現敲減ATDC5細胞中的SIRT1基因可以引起該細胞的退變[17]。PARK等[18]通過VEGF基因慢病毒感染胃癌細胞，發現感染后可影響胃癌細胞增殖和腫瘤生長。MA等[19]發現通過IARS2基因慢病毒感染人黑色素瘤A375細胞，證明該慢病毒可調控A375細胞的增殖及凋亡。CUI等[20]發現CRAD慢病毒感染人肺癌細胞，可通過claudin4調節人肺癌細胞生長及凋亡。由此可知，慢病毒感染技術在醫學及生物學研究中應用廣泛。但是，Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細胞的相關模型少有報道，因此本研究團隊構建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并用其感染了RSC96雪旺細胞，通過綠色熒光的表達觀察到慢病毒感染情況。細胞中Wnt5a mRNA的平均表達量為0.206±0.056。

當然，本研究也存在一定的不足之處。首先，本研究是一個描述性、觀察性研究，僅僅介紹了構建Wnt5a基因慢病毒的方法及其感染RSC96雪旺細胞后的mRNA表達情況，缺乏對照組，也缺少蛋白層面的檢測。其次，細胞模型只能在離體條件下證明Wnt5a基因的作用，仍需要動物模型進一步證明其與細胞實驗中的一致性，這些也是作者需要繼續研究的內容。

綜上所述，本研究構建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并成功利用其感染了RSC96雪旺細胞，檢測了其Wnt5a mRNA表達量。通過建立相關細胞模型，可為周圍神經損傷修復的相關研究提供參考。