脛骨干骨折骨不連患者外周血Treg細胞頻率變化研究*

陳明輝，歐陽正曉，鄧件良△

(1.長沙市中心醫院骨科，湖南 長沙 410004；2.中南大學湘雅二醫院骨科，湖南 長沙 410012)

如何促進骨折后的骨骼愈合、減少骨不連的發生，一直是臨床關注的熱點問題之一。數據顯示，2018年全球骨折發病率約為2%，但因骨折愈合過程十分復雜，盡管嚴格依照治療規范進行處理，骨折骨不連的發病率仍高達5%～10%[1]。脛骨干骨折是臨床中最常見的長骨骨折類型之一，一般采用手術治療，但易于發生骨不連，影響患者的生活質量。因此，對脛骨干骨折患者術后的愈合情況進行及時評估及干預十分重要。

骨折的愈合過程復雜，涉及免疫細胞、間充質干細胞及其他多種細胞、細胞信號分子。已有研究顯示，T淋巴細胞根據亞群不同，可對骨折愈合起到促進或者抑制作用[2]。其中，調節性T細胞(Treg細胞)作為具有重要免疫調節、免疫抑制功能的T細胞亞群，其數目或功能異常已被證實與多種炎癥性疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤相關。此外，免疫系統的T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC細胞)等都與破骨細胞、成骨細胞具有相互作用[3-4]。因此，作者認為Treg細胞異常可能也在骨折骨不連的過程中發揮了一定作用，對脛骨干骨折骨不連患者Treg細胞頻率的變化進行了研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究共納入自2015年5月至2020年8月長沙市中心醫院收治的60例脛骨干骨折患者，術后根據脛骨干骨折影像學愈合評分系統(RUST)評分，將患者分為骨折正常愈合組45例，骨折骨不連組15例。此外，納入45例無骨折者作為健康對照組。骨折正常愈合組中，男25例，女20例，平均年齡(41.7±5.9)歲，平均體重(64.55±11.34)kg，平均受傷至手術時間為6.3 d。骨折骨不連組中，男9例，女6例，平均年齡(42.1±6.1)歲，平均體重(63.87±10.91)kg，平均受傷至手術時間為6.4 d。健康對照組中，男23例，女22例，平均年齡(41.9±5.5)歲，平均體重(64.10±10.25)kg。3組在年齡、性別、體重等方面比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)年齡大于或等于18歲；(2)單純外傷導致的單側脛骨干骨折，經臨床體征與影像學檢查確診；(3)研究獲得醫院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：(1)骨質疏松癥、骨腫瘤、骨結核等疾病導致的病理性骨折；(2)患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病；(3)長期使用糖皮質激素或其他免疫抑制劑藥物；(4)患有精神疾病或者其他身體器官嚴重疾病。

1.2方法 入院后，對患者進行血常規、大小便常規、心電圖、胸部X線片、X線、計算機斷層掃描(CT)等檢查。根據患者病情，對骨折采用外固定架、鋼板或髓內釘固定，必要時行自體骨移植。術后第1、2、4、8、12、16、20、24周復查，采用RUST評估患者脛骨干骨折愈合情況。若第24周RUST評分大于或等于7分，且骨折處無壓痛、無異常移位，評定為骨折正常愈合，否則評定為骨折骨不連。于術前和術后1、4、24周分別采集各組受試者3～5 mL外周靜脈血標本，室溫下以2 000 r/min離心30 min，在無制動狀態下自然停止，收集外周血單個核細胞(PBMC)，隨后洗滌PBMC2次，加入抗CD4-APC-Cy7、抗CD25-PE熒光抗體，流式表面熒光抗體標記染色20 min。洗滌PBMC2次，用Fix/Perm液及Perm液處理30 min；洗滌1次，加入抗FOXP3-Alexa Fluor-488熒光抗體，流式胞內熒光抗體染色60 min。洗滌后，立即用流式細胞儀檢測CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞數量。流式熒光抗體均購于美國Biolegend公司，流式細胞儀為美國BD公司的FACSCanto Ⅱ流式細胞儀。

2 結 果

術前，健康對照組CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞頻率(Treg細胞占CD4+T細胞比例)為(4.28±1.35)%，骨折正常愈合組Treg細胞頻率為(7.53±2.21)%，骨折骨不連組Treg細胞頻率為(6.29±1.74)%。健康對照組Treg細胞頻率低于骨折正常愈合組及骨折骨不連組，差異均有統計學意義(P<0.05)。術后1、4周，骨折骨不連組及骨折正常愈合組Treg細胞頻率較術前均呈升高趨勢，健康對照組Treg細胞仍低于骨折骨不連組及骨折正常愈合組，差異均有統計學意義(P<0.05)。術后4周，骨折正常愈合組Treg細胞頻率明顯高于骨折骨不連組，差異有統計學意義(P<0.05)。術后24周，3組間Treg細胞頻率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

3 討 論

脛骨干骨折是臨床常見的骨折，約占全身骨折的12%。由于骨折后局部血運變差、脛骨的開放性及感染等因素，患者術后常發生骨折延遲愈合，甚至骨不連等嚴重并發癥，發病率高達48%[5]。骨不連患者常需經歷多次反復手術及長時間的后續治療，患者患處的疼痛、功能障礙，以及反復外科治療不僅給患者帶來了巨大的軀體痛苦和心理壓力，也會給患者家庭造成沉重經濟負擔[6]。因此，骨不連一直是骨科領域的重點和難點問題。解剖復位、堅固固定、促進骨折愈合、加強成骨能力均是骨不連治療的關鍵。骨折愈合過程涉及骨細胞、破骨細胞、成骨細胞等的增殖、分化，免疫細胞也參與骨折后骨再生的調節。骨折時常伴隨發生周圍組織及血管系統損傷，繼而引發局部炎性反應，形成血腫[7]。骨折局部及血腫周圍的高濃度促炎性因子可吸引、募集各種免疫細胞，包括中性粒細胞、巨噬細胞、間充質干細胞等。巨噬細胞在炎性環境下分化為促炎性M1表型，進一步激活獲得性免疫反應，特別是激活T淋巴細胞。動物實驗結果表明，T細胞減少影響成骨細胞成熟，導致骨質礦化延緩，缺乏T細胞的大鼠骨折后骨質修復及骨重建均顯著減緩[8-9]。Treg細胞是一類重要CD4+T細胞亞群，具有免疫調節功能，其經典表型為CD4+CD25+FOXP3+。Treg細胞的經典免疫調節作用包括抑制自身反應性T細胞活動，誘導建立免疫耐受，以及抑制炎性反應。Treg細胞可促進成骨細胞并抑制破骨細胞活動[10]。此外，Treg細胞可通過分泌轉化生長因子-β、白細胞介素-10等經典的抗炎性細胞因子，以調節促炎性Th1細胞的活動，或誘導抗炎性miRNA的表達，從而抑制骨折局部炎性反應[11-12]。

本研究中采用流式細胞學技術對脛骨干骨折患者外周血的Treg細胞頻率進行了動態檢測，結果顯示，術前和術后1、4周，骨折正常愈合組及骨折骨不連組Treg細胞頻率均高于健康對照組，且隨時間進展呈升高趨勢，提示Treg細胞在骨折后參與骨質修復與重建。值得注意的時，術后4周，骨折正常愈合組Treg細胞頻率明顯高于骨折骨不連組。術后24周，3組間Treg細胞頻率未再觀察到顯著差異。以上結果表明，骨折骨不連患者在骨折后早期，Treg細胞比例低于正常愈合患者，Treg細胞不足可能導致成骨細胞活動受抑及局部炎癥清除障礙，從而引起骨折骨不連。