復(fù)方黃芪口服液聯(lián)合化療藥物抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制研究*

顧瑛媛 ，普曉佳 ，殷娜 ，萬春平

（1.常州市中醫(yī)醫(yī)院，常州 213003；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明 650021）

化療是惡性腫瘤綜合治療的重要手段之一，但是由于化療藥物的毒性及非選擇性，往往對腫瘤患者造成嚴(yán)重的毒副作用。復(fù)方黃芪口服液是依據(jù)孟河醫(yī)派學(xué)術(shù)思想總結(jié)出來的治療腫瘤的院內(nèi)制劑，該制劑主要由黃芪、黃精、人參和陳皮4味藥物組成，具有扶正祛邪、益氣固表和補(bǔ)虛益損等功效。現(xiàn)代藥理研究表明本方具有改善心、腦、腎血液循環(huán)及調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用，臨床被廣泛用于提高腫瘤患者扶正抗邪能力與人體免疫力。復(fù)方黃芪口服液已在常州市中醫(yī)醫(yī)院應(yīng)用25年余，近3年來治療患者13 000余人次，具有較好的臨床療效，深受廣大患者歡迎。然而迄今為止，復(fù)方黃芪口服液的抗腫瘤免疫效應(yīng)尚未明確，因此有必要進(jìn)一步深入研究。

機(jī)體抗腫瘤免疫的主要方式是細(xì)胞免疫，其中T淋巴細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞。CD4+輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）可分別識(shí)別腫瘤細(xì)胞內(nèi)外的抗原肽分子，在一系列輔助信號(hào)的參與下，被誘導(dǎo)激活并介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤組織中浸潤的Ⅰ型輔助性T細(xì)胞（Th1細(xì)胞）通過分泌干擾素-γ（IFN-γ）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等浸潤到腫瘤部位，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在腫瘤組織高表達(dá)，具有免疫抑制性，能夠介導(dǎo)腫瘤免疫耐受。本研究以常州市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑復(fù)方黃芪口服液為研究對象，以T細(xì)胞亞群為切入點(diǎn)，研究復(fù)方黃芪口服液聯(lián)合化療藥物抗腫瘤的免疫效應(yīng)及作用機(jī)制，以期解釋中醫(yī)“正氣”的科學(xué)內(nèi)涵并使復(fù)方黃芪口服液更好地應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量（20～22）g，雌性，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。上述動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)至少1周后開始實(shí)驗(yàn)。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后自由攝取。

1.2 藥物與試劑 復(fù)方黃芪口服液由常州市中醫(yī)醫(yī)院提供。RPMI-1640培養(yǎng)基購自GibcoBRL公司；胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；APC-小鼠白細(xì)胞介素-17A（IL-17A）抗體、FITC-小鼠IFN-γ抗體、PE-Cy7小鼠CD4抗體購自美國Biolegend公司；PE-小鼠叉頭樣/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）抗體購自 BD PharMingen公司；Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set購自eBioscience公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 血液分析系統(tǒng)購自日本Sysmex公司；離心機(jī)購自德國Thermo Scientific Heraeus公司；3111二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo-fisher公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.4 細(xì)胞株 H22鼠源小鼠細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法與評價(jià)

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立、分組和給藥 選取接種8 d的H22鼠源小鼠，腹部皮膚消毒后抽取腹水，離心（1 200 r/min，4℃，5 min，離心半徑 25 cm）后棄上清，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，每次于小鼠右側(cè)腋部皮下接種0.2 mL，次日將接種的小鼠隨機(jī)分為4組，分別為荷瘤模型組、復(fù)方黃芪口服液組、環(huán)磷酰胺組和聯(lián)合用藥組，每組8只。腫瘤接種后第2天開始給藥，環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺（30 mg/kg），復(fù)方黃芪口服液組以100 mg/kg劑量灌胃給藥，聯(lián)合用藥組在腹腔注射環(huán)磷酰胺（30 mg/kg）基礎(chǔ)上灌胃復(fù)方黃芪口服液（100 mg/kg）。荷瘤模型組灌胃等體積的生理鹽水。以上各組每日給藥1次，連續(xù)16 d。末次給藥24 h后，脫頸椎方式處死小鼠，剝離腫瘤組織，稱取質(zhì)量并計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率（%）=[（對照組平均腫瘤質(zhì)量-治療組平均腫瘤質(zhì)量）÷對照組平均腫瘤質(zhì)量]×100%。

2.2 脾淋巴細(xì)胞的制備 小鼠脫脊椎處死后無菌取其脾臟，將脾臟用玻璃片磨碎，過膜，離心（1200r/min，4℃，5 min，離心半徑25 cm）。棄去上清，沉淀加入紅細(xì)胞裂解液（每個(gè)脾臟約1mL），混勻，靜置1min，加入 PBS，離心（1 200 r/min，4℃，5 min，離心半徑25 cm）。再加入 PBS，過膜，離心（1 200 r/min，4℃，5 min，離心半徑25 cm）。將所剩細(xì)胞洗滌1～2次后，用含10%FBS的RPMI-1640將細(xì)胞調(diào)至所需濃度。

2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖功能的檢測 各組脾淋巴細(xì)胞接種于 96孔板（4×105個(gè)/孔），同時(shí)加入 2.5 μg/mL刀豆蛋白A（ConA）進(jìn)行刺激，細(xì)胞于含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法測定各組脾淋巴細(xì)胞的增殖情況。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測 對于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色：分離各組小鼠脾淋巴細(xì)胞，與乙酰肉豆蔻佛波酯（PMA）、離子霉素（ionomycin）及布雷菲德菌素A（BFA）于5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4 h，結(jié)束后收集細(xì)胞，冼液洗滌2次，加入免疫球蛋白G（IgG）抗體封閉氟達(dá)拉濱+環(huán)磷酰胺+利妥昔單抗（FCR），4℃作用10 min以封閉 Fcγ受體（FcγR），F(xiàn)ACS洗液洗滌1次后，加入PE-Cy7小鼠CD4抗體，進(jìn)行表面標(biāo)志染色。完畢后，固定液中固定，F(xiàn)ACS洗液洗滌1次，將細(xì)胞懸于穿膜液中，加入抗IL-17A和IFN-γ熒光染料，流式細(xì)胞儀檢測分析。對于細(xì)胞內(nèi)特異轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的檢測，無需上述刺激，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，流式細(xì)胞儀檢測，flowjo軟件分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應(yīng)的影響 結(jié)果顯示，與荷瘤模型組比較，復(fù)方黃芪口服液組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合用藥組腫瘤質(zhì)量較低（P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺組比較，聯(lián)合用藥組腫瘤質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）g

表1 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）g

注：與荷瘤模型組比較，*P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量（mg/kg） 腫瘤質(zhì)量荷瘤模型組 8 - 1.38±0.19復(fù)方黃芪口服液組 8 100 0.89±0.23*環(huán)磷酰胺組 8 30 0.28±0.13*聯(lián)合用藥組 8 100（復(fù)方黃芪口服液）+30（環(huán)磷酰胺）0.26±0.03*

3.2 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖功能的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)黃芪口服液組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合用藥組A值顯著高于荷瘤模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，聯(lián)合用藥組A值顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表2 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能的影響（±s）

表2 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能的影響（±s）

注：與荷瘤模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，#P<0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量（mg/kg） A值荷瘤模型組 8 - 0.64±0.02復(fù)方黃芪口服液組 8 100 0.87±0.02**環(huán)磷酰胺組 8 30 0.48±0.07*聯(lián)合用藥組 8 100（復(fù)方黃芪口服液）+30（環(huán)磷酰胺）0.76±0.08**#

3.3 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠血常規(guī)的影響 藥物干預(yù)16 d后眼眶取血進(jìn)行血常規(guī)檢測，結(jié)果顯示，與荷瘤模型組小鼠比較，環(huán)磷酰胺組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，聯(lián)合用藥組白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見表3。

表3 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠血常規(guī)功能的影響（±s） ×109/L

表3 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠血常規(guī)功能的影響（±s） ×109/L

注：與荷瘤模型組比較，*P<0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量（mg/kg） 白細(xì)胞數(shù) 中性粒細(xì)胞數(shù) 單核細(xì)胞數(shù)荷瘤模型組 8 - 6.66±0.29 2.06±0.70 0.38±0.37復(fù)方黃芪口服液組 8 100 6.05±1.47 1.45±0.72 0.27±0.14環(huán)磷酰胺組 8 30 2.38±0.48* 0.59±0.18* 0.12±0.05聯(lián)合用藥組 8 100（復(fù)方黃芪口服液）+30（環(huán)磷酰胺）3.42±0.32## 0.99±0.29# 0.29±0.23

3.4 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1細(xì)胞表達(dá)的影響 FACS檢測結(jié)果表明，與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組能夠顯著抑制H22荷瘤小鼠 Th1細(xì)胞（CD4+IFN-γ+T細(xì)胞）比例（P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺組比較，聯(lián)合用藥組Th1細(xì)胞比例升高（P<0.05）。見圖 1。

圖1 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠Th1細(xì)胞（IFN-γ）表達(dá)的影響（±s，n=8）

3.5 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)的影響 Treg細(xì)胞是機(jī)體維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞具有天然的免疫抑制力，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。FACS檢測結(jié)果表明，與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組Treg細(xì)胞表達(dá)水平增加，降低了機(jī)體抗腫瘤的免疫反應(yīng)。與環(huán)磷酰胺組比較，聯(lián)合用藥組小鼠體內(nèi)具有免疫抑制作用的CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞比例下調(diào)（P＜0.05），提示復(fù)方黃芪口服液聯(lián)合環(huán)磷酰胺能夠下調(diào)Treg細(xì)胞比例，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的免疫效應(yīng)。見圖2。

圖2 復(fù)方黃芪口服液對H22荷瘤小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)的影響（±s，n=8）

4 討論

復(fù)方黃芪口服液依據(jù)孟河醫(yī)派學(xué)術(shù)思想，運(yùn)用現(xiàn)代制劑工藝，制成口服制劑[2-3]。虛證多指正氣虛弱，現(xiàn)代研究表明虛證患者常表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下、體液免疫功能紊亂，可見“正氣”是機(jī)體免疫能力的一種中醫(yī)表達(dá)方式[4]。化療是治療腫瘤的一個(gè)重要手段，腫瘤化療最常見的問題是化療藥對骨髓干細(xì)胞的毒性作用，從而導(dǎo)致白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，使治療中斷，腫瘤得不到控制。由化療所致的白細(xì)胞減少癥，臨床上表現(xiàn)為頭目昏眩、神疲乏力、面色無華，可歸為中醫(yī)虛證。環(huán)磷酰胺是常用的腫瘤化療藥物，其應(yīng)用廣泛，能殺死有絲分裂和進(jìn)入循環(huán)周期的細(xì)胞，且無選擇性，對骨髓干細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，從而導(dǎo)致白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量減少。同時(shí)對機(jī)體免疫功能具有較強(qiáng)的抑制作用，導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染[5]。

本研究通過構(gòu)建H22荷瘤小鼠模型，從抗腫瘤療效、白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖、T細(xì)胞亞群表達(dá)等多個(gè)層面揭示復(fù)方黃芪口服液聯(lián)合化療藥物環(huán)磷酰胺抗腫瘤的免疫效應(yīng)及機(jī)制，為復(fù)方黃芪口服液的進(jìn)一步研究和臨床推廣奠定理論基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，與單用環(huán)磷酰胺相比，復(fù)方黃芪口服液聯(lián)合環(huán)磷酰胺對腫瘤的抑制效應(yīng)無顯著影響，然而其能夠顯著增加白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)，提高荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞的增殖功能。

腫瘤免疫治療遵循免疫識(shí)別、免疫活化和免疫效應(yīng)3個(gè)基本過程，T淋巴細(xì)胞是這一過程中的主要實(shí)施者[6]。未致敏的CD4 T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激活化后成為CD4+T淋巴細(xì)胞，CD4+T淋巴細(xì)胞在不同因素作用下，進(jìn)一步向Th1、Ⅱ型輔助性T細(xì)胞（Th2）、Treg細(xì)胞等功能性細(xì)胞類型分化。Th1類細(xì)胞主要分泌 IFN-γ、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-12（IL-12），在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用[7]。Th2 細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4），主要介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)。Treg細(xì)胞主要在胸腺產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)免疫耐受，通過分泌細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，這些T淋巴細(xì)胞亞群的平衡與抗腫瘤免疫密切相關(guān)[8]。FACS檢測結(jié)果表明，復(fù)方黃芪口服液聯(lián)合環(huán)磷酰胺能夠提高H22荷瘤小鼠Th1細(xì)胞（IFN-γ）比例，下調(diào)具有免疫負(fù)調(diào)控作用的Treg細(xì)胞比例，提示復(fù)方黃芪口服液可能通過促進(jìn)Th1的激活，下調(diào)Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫負(fù)調(diào)控機(jī)制，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。