黃芩苷-小檗堿復(fù)合物納米晶的制備和在體腸吸收評(píng)價(jià)*

劉羿廷 ，馬旭彤 ，王繼林 ，彭輝 ，皮佳鑫 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617）

多數(shù)中藥成分溶解度低，口服吸收效果差，嚴(yán)重制約了中藥質(zhì)量基礎(chǔ)的科學(xué)解釋和臨床應(yīng)用。目前，納米晶已經(jīng)成為提高中藥難溶性成分口服吸收的重要途徑，其具有增加藥物溶解度和滲透性、提高生物利用度、減輕或避免毒副作用的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，較高載藥量的特點(diǎn)滿足了大劑量中藥口服的需要，具有良好的應(yīng)用前景。

中藥湯劑中往往存在沉淀形式的具有生理活性的化合物[1]，在臨床使用中，這些沉淀因溶解度差等原因通常被舍棄，造成活性成分減少、藥效降低。黃芩、黃連共煎會(huì)產(chǎn)生大量絮狀沉淀[2]，這是黃芩中的黃芩苷（BA）等黃酮類酸性成分和黃連中的小檗堿（Ber）等生物堿類成分在共同煎煮的過(guò)程中發(fā)生相互作用，生成BA-Ber復(fù)合物而產(chǎn)生的“自沉淀”現(xiàn)象[3]。初步藥效學(xué)結(jié)果表明，BA-Ber復(fù)合物具有抗炎活性，對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞有不同程度的保護(hù)修復(fù)功能，能夠治療潰瘍性結(jié)腸炎和腹瀉型腸易激綜合征等疾病[4]。但是BA-Ber復(fù)合物溶解度低于BA和Ber，進(jìn)而影響其在胃腸道內(nèi)的吸收[5]。

本研究以“自沉淀”原理制備的BA-Ber復(fù)合物為模型藥物，利用抗溶劑法結(jié)合高壓均質(zhì)法制備BA-Ber復(fù)合物納米晶，并對(duì)納米晶進(jìn)行表征和在體腸吸收評(píng)價(jià)，考察納米晶對(duì)中藥難溶性成分口服吸收的影響。

1 材料

1.1 儀器 萬(wàn)分之一天平（F124，天津億諾科學(xué)儀器有限公司），超純水系統(tǒng)（Mill-QII，美國(guó)Millipore公司），恒流泵（BT100-1L，保定蘭格恒流泵有限公司），十萬(wàn)分之一天平（XP205，瑞士MettlerToledo公司），激光粒徑測(cè)定儀（Nano-ZS，英國(guó) Marlvern公司），場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8020，日本日立公司），加熱磁力攪拌器（RET，德國(guó)IKA集團(tuán)），透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（TK-20B，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），高速攪拌儀（RW20，德國(guó)IKA集團(tuán)），高壓均質(zhì)機(jī)（AH100D，奧地利ATS公司）。

1.2 試藥 二甲基亞砜（DMSO，天津市津科精細(xì)化工研究所），BA對(duì)照品（含量≥95.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），Ber對(duì)照品（含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司），黃芩素（BE）對(duì)照品（含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司），BA-Ber復(fù)合物（自制），泊洛沙姆188（P188，德國(guó)BASF股份公司）。維生素 C、氯化鉀（KCl）、無(wú)水氯化鈉（NaCl）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、十二水磷酸二氫鈉（Na2HPO4·12H2O）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）、葡萄糖均為分析純。

1.3 動(dòng)物 健康SD大鼠（200～250 g），雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK-（京）2016-0006，相關(guān)研究遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 BA-Ber復(fù)合物及納米晶的制備

2.1.1 BA-Ber復(fù)合物的制備 參照文獻(xiàn)[6]并優(yōu)化其反應(yīng)條件，以摩爾比1∶1比例精密稱取BA、Ber原料藥，置于圓底燒杯中加入適量水，于60℃熱回流反應(yīng)2 h。沉淀物抽濾，濾餅用甲醇溶解，旋蒸，靜置揮發(fā)溶劑，干燥后即得復(fù)合物。

2.1.2 BA-Ber復(fù)合物納米晶的制備 用DMSO配制1 mg/mL的BA-Ber復(fù)合物溶液，緩慢注入含有0.25%P188的水溶液中，以900 r/min攪拌30 min，轉(zhuǎn)入高壓均質(zhì)機(jī)900 bar循環(huán)20次即得。

2.2 BA-Ber復(fù)合物納米晶的表征

2.2.1 形態(tài)考察 取少量BA-Ber復(fù)合物和納米晶，真空干燥后表面噴金置電子顯微鏡下于不同倍率觀察所得粒子的表面形態(tài)。

2.2.2 粒徑、多分散系數(shù)及Zeta電位 采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定BA-Ber復(fù)合物納米晶的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）及Zeta電位。

2.3 溶液配制

2.3.1 Hank平衡鹽溶液緩沖液（HBSS緩沖液）的配制 分別稱取NaCl 8.00 g、KCl 0.40 g、CaCl20.14 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、Na2HPO4·12H2O 0.06 g、NaHCO30.35 g、葡萄糖 1.00 g、KH2PO40.06 g，加適量超純水溶解，并定容至1 L，用HCl/NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8～7.4，加入2.00 g維生素C并充分溶解，制得HBSS緩沖液，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹7]。

2.3.2 空白灌流液的制備 取禁食12 h（自由飲水）的SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉（1.0 g/kg），固定，沿其腹中線剪開(kāi)，在其十二指腸的上端和回腸的下端切口，于切口處插管結(jié)扎，用預(yù)熱至37℃的HBSS緩沖液將腸內(nèi)容物沖洗干凈，再用空白HBSS緩沖液以2 mL/min的流速灌流。待腸段內(nèi)全部充滿液體并穩(wěn)定10 min后開(kāi)始接收灌流液，收集10～120 min內(nèi)的灌流流出液作為空白灌流液。收集到的灌流液以12 000 r/min離心10 min（離心半徑16.8 cm），取上清液合并，4℃冷藏備用。

2.3.3 腸灌流供試液的制備 精密稱取BA-Ber復(fù)合物納米晶適量，以HBSS緩沖液稀釋，得納米晶腸灌流供試液，其中BA、Ber的濃度均約為40 μg/mL。

2.3.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取BA、Ber、BE對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解，制備對(duì)照品貯備溶液。取上述對(duì)照品貯備溶液各1 mL，以HBSS緩沖液定容于10 mL容量瓶，制得BA、Ber、BE濃度分別為 208.4、215.2、212.0 μg/mL 混合對(duì)照品溶液。

2.4 分析方法的建立

2.4.2 專屬性考察 分別取空白腸灌流液、對(duì)照品溶液和腸灌流樣品溶液按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。考察空白腸灌流液對(duì)BA、Ber和BE的測(cè)定是否有干擾。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取一定量“2.3.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加入HBSS緩沖液稀釋成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備不同濃度的腸灌流供試液 （10、40、80 μg/mL），依“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定BA、Ber、BE的含量。

2.4.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的BA-Ber復(fù)合物納米晶各3份，每份分別約為0.5、2.0、4.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，再分別精密加入混合對(duì)照品溶液0.5、2、4 mL（混合對(duì)照品濃度：每1 mL溶液含 BA 208.4 μg 和 Ber 215.2 μg），按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算BA和Ber的平均回收率。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備不同濃度的腸灌流供試液（10、40、80 μg/mL），按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后 0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定BA、Ber、BE的含量。

2.5 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)

2.5.1 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)方法 取禁食12 h（自由飲水）的SD大鼠10只，隨機(jī)分成兩組，分別以BA-Ber復(fù)合物和其納米晶作為灌流液。腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉（1.0 g/kg），分離出4個(gè)待考察腸段[8]（十二指腸段自幽門(mén)1 cm處開(kāi)始，空腸段自幽門(mén)15 cm處開(kāi)始，回腸段自盲腸上行20 cm處開(kāi)始，結(jié)腸段緊臨回盲端下行），各個(gè)腸段分別取約10 cm于兩端切口，用預(yù)熱至37℃的HBSS緩沖液將腸內(nèi)容物沖洗干凈，于切口處插管結(jié)扎。進(jìn)口處用已知質(zhì)量并裝有供試液的西林瓶進(jìn)行灌流，流速0.2 mL/min，每間隔15 min在出口處用另一已知質(zhì)量的離心管收集1次，同時(shí)迅速更換下一個(gè)供試液西林瓶和接收液離心管，稱取更換下來(lái)的供試液西林瓶和接收液離心管的質(zhì)量，接收液渦旋混合3 min，于12 000 r/min、4℃離心10 min（離心半徑16.8 cm），吸取上清液 100 μL，加 100 μL 甲醇復(fù)溶，12 000 r/min、4℃離心10 min（離心半徑16.8 cm），取上清液進(jìn)樣，測(cè)定藥物濃度。實(shí)驗(yàn)持續(xù)105 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，剪下被灌流的腸段，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑。

2.5.2 數(shù)據(jù)處理 采用質(zhì)量法，按下列公式計(jì)算藥物有效滲透系數(shù)（Peff）[9]。

Vin和Vout分別為腸道進(jìn)出口接收液的體積（mL）；Cin和Cout分別為腸道進(jìn)口灌流液和出口接收液的濃度（mg/mL）；L為被灌流腸段的長(zhǎng)度（cm）；r為切面半徑（cm）；Q為灌流速度（mL/min）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 形態(tài)考察 結(jié)果表明，BA-Ber復(fù)合物為長(zhǎng)桿狀，表面光滑平整且排列整齊。制成納米晶為圓柱狀，分布均勻。BA-Ber復(fù)合物、BA-Ber復(fù)合物納米晶的表面形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 BA-Ber復(fù)合物、BA-Ber復(fù)合物納米晶的掃描電鏡圖

3.2 粒徑、多分散系數(shù)及Zeta電位 采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定BA-Ber復(fù)合物納米晶的粒徑、PDI及Zeta電位，結(jié)果顯示BA-Ber復(fù)合物納米晶粒徑為（225.10±9.12）nm，PDI為（0.27±0.04），Zeta 電位為（-10.10±0.70）mV。結(jié)果表明，BA-Ber復(fù)合物納米晶粒徑小且分布均一，體系穩(wěn)定性較好。粒徑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，Zeta電位測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 BA-Ber復(fù)合物納米晶粒徑分布圖

圖3 BA-Ber復(fù)合物納米晶電位分布圖

3.3 分析方法的建立與方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性 空白腸灌流液在以上色譜條件下對(duì)BA、Ber、BE 3種成分的測(cè)定無(wú)干擾。空白腸灌流液、混合對(duì)照品和腸灌流樣品溶液的色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 空白腸灌流液、混合對(duì)照品和腸灌流樣品溶液色譜圖

3.3.2 線性關(guān)系 以待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到BA、Ber、BE在HBSS緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程和回歸系數(shù)見(jiàn)表1，線性關(guān)系良好。

表1 BA、Ber、BE在HBSS溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.4 加樣回收率 計(jì)算BA、Ber的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，表明該方法加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

3.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 計(jì)算得低濃度供試品溶液RSD為0.29%～1.85%（n=6），中濃度供試品溶液RSD為0.22%～1.23%（n=6），高濃度供試品溶液RSD為0.13%～1.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

表2 加樣回收率考察（±s）%

表2 加樣回收率考察（±s）%

成分 樣本數(shù) 低濃度 中濃度 高濃度BA 3 97.01±1.94 98.75±2.11 98.37±2.36 Ber 3 102.75±0.67 101.78±1.80 100.51±0.96

3.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 計(jì)算得低濃度供試品溶液RSD為0.02%～1.98%（n=6），中濃度供試品溶液RSD為0.20%～0.92%（n=6），高濃度供試品溶液RSD為0.66%～1.73%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.4 BA-Ber復(fù)合物納米晶大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用在體單向腸灌流，對(duì)BA-Ber復(fù)合物納米晶中BA和Ber在腸道中的吸收情況進(jìn)行了考察，通過(guò)計(jì)算得其Peff值。結(jié)果顯示，BA-Ber復(fù)合物在各個(gè)腸段均有吸收，制成納米晶后，BA在結(jié)腸吸收最好，Peff為（49.82±10.95）×10-3cm/min。在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸4個(gè)腸段中，納米晶組BA的Peff分別是復(fù)合物組的 2.99、2.00、2.66、5.58 倍，與復(fù)合物組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。納米晶組 Ber在空腸吸收最好，Peff為（16.69±2.45）×10-3cm/min。納米晶組Ber的Peff分別是復(fù)合物組的1.25、1.18、1.53、1.80倍，兩組在十二指腸、結(jié)腸的Peff比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。研究結(jié)果表明，BA-Ber復(fù)合物制成納米晶后在各個(gè)腸段吸收均有所增加。BA-Ber復(fù)合物納米晶能夠顯著增加BA、Ber在大鼠腸道的吸收。見(jiàn)表 3、表 4。

表3 BA-Ber復(fù)合物納米晶中BA在大鼠各腸段的Peff值（±s） ×10-3cm/min

表3 BA-Ber復(fù)合物納米晶中BA在大鼠各腸段的Peff值（±s） ×10-3cm/min

注：同一腸段與復(fù)合物組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別復(fù)合物組納米晶組樣本數(shù)5 5十二指腸10.06±0.60 30.06±3.56**空腸12.38±4.70 24.79±2.85*回腸12.14±6.25 32.29±2.93**結(jié)腸8.92±2.12 49.82±10.95**

表4 BA-Ber復(fù)合物納米晶中Ber在大鼠各腸段的Peff值（±s） ×10-3cm/min

表4 BA-Ber復(fù)合物納米晶中Ber在大鼠各腸段的Peff值（±s） ×10-3cm/min

注：同一腸段與復(fù)合物組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

樣本數(shù)組別復(fù)合物組納米晶組5 5十二指腸10.00±0.51 12.55±1.07*空腸11.86±4.45 14.01±0.48回腸10.89±5.12 16.69±2.45結(jié)腸8.86±0.72 15.98±2.80**

4 討論

4.1 納米晶藥物理化性質(zhì)表征 對(duì)藥物進(jìn)行納米化的目的是提高其溶解速度和生物利用度。藥物的粒徑減小，粒子表面積增大，藥物溶出速率也會(huì)隨之提高[10]。因此，粒徑及粒徑分布是評(píng)估納米晶的重要屬性之一。此外，藥物納米顆粒的不同形態(tài)對(duì)于口服吸收效果也有一定影響[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)BABer復(fù)合物納米晶進(jìn)行形態(tài)、粒徑、粒徑分布及Zeta電位的表征研究與數(shù)值測(cè)定，結(jié)果提示復(fù)合物納米晶外觀呈光圓平整的短棒狀，粒徑在200～300 nm且分布均勻，其尺寸和形貌符合納米晶粒子的一般屬性，為后續(xù)開(kāi)展體內(nèi)外評(píng)價(jià)研究提供了前提條件。

4.2 單向腸灌流模型和Peff研究藥物腸道吸收的實(shí)驗(yàn)方法有很多種，體內(nèi)（藥物濃度法）、在體（在體灌流法等）、離體（外翻腸環(huán)法、腸囊外翻模型等）及人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞（Caco-2）細(xì)胞模型法應(yīng)用較為廣泛[12]。在體腸灌流模型具有操作方便、準(zhǔn)確性高、未切斷腸道神經(jīng)、比離體法更接近機(jī)體內(nèi)的真實(shí)吸收狀態(tài)并保證了血液及淋巴液的正常供應(yīng)，且測(cè)得的吸收速率等指標(biāo)與體內(nèi)法相近等優(yōu)勢(shì)[13]。灌流方式主要分為振動(dòng)灌流、循環(huán)灌流和單向灌流，而單向灌流因有較低的流速（0.2～0.3 mL/min）并對(duì)腸壁黏膜損傷較輕，且更接近藥物口服給藥后的腸道環(huán)境，吸收速率更穩(wěn)定，故與人體有較好的相關(guān)性，因此本實(shí)驗(yàn)選用0.2 mL/min作為灌注流速。同時(shí)，小腸在吸收過(guò)程中不但吸收藥物而且吸收水分，腸腔內(nèi)的水分改變會(huì)影響藥物濃度。因此，可以采用質(zhì)量法對(duì)水分進(jìn)行校正。

在體腸灌流模型通過(guò)測(cè)定灌流前后藥物濃度的變化來(lái)評(píng)價(jià)藥物在小腸的吸收（吸收速率及吸收量等），并計(jì)算Peff等吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)。藥物吸收性能按 Peff分為 3 類：Peff＜0.18×10-3cm/min 為吸收差，Peff＞1.2×10-3cm/min 為吸收完全，介于兩者之間的為中等吸收。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BA-Ber復(fù)合物灌流后，BA、Ber在大鼠各個(gè)腸段Peff均大于1.2×10-3cm/min，提示吸收良好；制備納米晶后，BA、Ber的腸吸收進(jìn)一步增加。

4.3 BA及黃芩素藥理作用及體內(nèi)轉(zhuǎn)化 BA的體內(nèi)吸收常表現(xiàn)出雙峰效應(yīng)。BA經(jīng)十二指腸快速吸收后，進(jìn)入空腸呈現(xiàn)為游離態(tài)，隨時(shí)間延長(zhǎng)腸道內(nèi)微生物將游離態(tài)BA代謝為苷元BE[14]。BE具有較大疏水性，易通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散方式進(jìn)入小腸壁上皮細(xì)胞。進(jìn)入腸壁上皮細(xì)胞后，BE經(jīng)尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶）作用又代謝為BA，隨后部分BA經(jīng)多藥耐藥相關(guān)蛋白3（MRP3）轉(zhuǎn)運(yùn)入血，由腸系膜靜脈進(jìn)入肝臟，在肝臟進(jìn)一步被代謝；另有部分BA則被多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）重新泵回腸道中，這就是BE的腸道首過(guò)代謝作用[15]。

考慮到BA的腸道轉(zhuǎn)化，故本研究在進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，建立了同時(shí)測(cè)定BA、BE含量的分析方法，并測(cè)定BA、BE含量，將BE含量轉(zhuǎn)化為等摩爾BA，用以校正因BA轉(zhuǎn)化、濃度降低造成的“假吸收”現(xiàn)象。此外，為了提高藥物穩(wěn)定性、防止BA分解，添加了維生素C并適當(dāng)調(diào)節(jié)了溶液pH制備腸灌注液。

4.4 納米晶對(duì)中藥難溶性成分BA和Ber在腸道中的吸收促進(jìn)作用 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米晶顯著提高了BA-Ber復(fù)合物的腸吸收，其可能的原因是形成納米晶后，粒徑減小，表面積增大，提高了藥物溶解速率和滲透性。其機(jī)制還與藥物在胃腸道的主動(dòng)運(yùn)輸、被動(dòng)擴(kuò)散以及多種蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑有關(guān)。藥物粒徑減小，表面能增大，增強(qiáng)了藥物在細(xì)胞表面的被動(dòng)吸附作用以及靶向細(xì)胞膜特異性受體與配體之間的相互識(shí)別，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用[16]。

因此，將藥物制成納米晶，可以提高藥物在體內(nèi)的溶解度和滲透性，使藥物更易被腸黏膜攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增加了藥物在腸道中的吸收，提高了生物利用度。