基于UPLC-Q-TOF/MS技術的橘皮竹茹湯血清藥物化學初步研究*

王小雙，魏文峰，韓德強，霍金海，王偉明

（黑龍江省中醫藥科學院中藥研究所，哈爾濱 150036）

橘皮竹茹湯源自張仲景的《金匱要略》，由橘皮、大棗、竹茹、人參、生姜、甘草組成。原文為：“噦逆者，橘皮竹茹湯主之。”后世醫家以“胃虛有熱，胃氣上逆”“寒熱相搏”“脾胃虛寒，胃失和降”等概括本方病因病機[1]。現代研究表明，橘皮竹茹湯已廣泛應用于醫治慢性胃炎、幽門水腫、幽門不全梗阻、消化性潰瘍、消化功能不良引起的嘔吐、反流性食管炎等疾病[2-4]。

超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用（UPLC-Q-TOF/MS）技術是一種具有高分辨率、高靈敏度特點的質譜技術。目前大量研究報道了UPLC-Q-TOF/MS作為一種分析方法被應用于中藥或中藥復方的入血成分研究，且實驗結果良好[5-6]。

中藥成分復雜，想要確定中藥入血后的有效成分并闡明其藥效物質基礎，通過現代化的分析手段對其給藥后血清進行原型成分以及代謝產物分析是必不可少的。同時，尚未有橘皮竹茹湯入血成分研究的相關報道，所以本實驗旨在采用UPLC-QTOF/MS技術推斷或鑒定其入血成分。

1 材料與儀器

1.1 儀器 實驗用儀器具體情況見表1。

表1 實驗儀器情況

1.2 試劑與藥品 對照品甘草酸（批號G-003-160330）、刺芒柄花素（批號 C-018-160304）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；柚皮苷（批號110722-201815）購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水合氯醛（批號20100827，天津市光復精細化工研究所）；自制橘皮竹茹湯凍干粉（陳皮飲片購自湖北隨州，批號17112111；竹茹飲片購自安徽岳西，批號1708311；大棗飲片購自河北安國，批號1709061；人參飲片購自吉林通化，批號180311；生姜飲片購自浙江磐安，批號ZJP2011165；甘草飲片購自甘肅隴西，批號17111411）。

1.3 實驗動物 健康雄性Wister大鼠，體質量（200±20）g，SPF級，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心供給，許可證號：SYXK（黑）2016-008。大鼠于SPF級動物室飼養，室溫20～25℃，濕度50%～70%。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液的制備 取橘皮竹茹湯凍干粉1.0g，精密稱定，加甲醇25 mL，超聲處理（功率300 W，頻率 40 KHz）30 min，放冷，補足甲醇，搖勻，濾過，取續濾液，13 000 r/min離心5 min（離心半徑7 cm），取上清液，即得。

2.2 給藥藥液的制備 取橘皮竹茹湯凍干粉，加適量蒸餾水超聲溶解，制成0.108 g/mL藥液供大鼠灌胃使用。

2.3 血清樣本的制備 Wister大鼠禁食12 h（自由飲水），給藥組按照10.8 g/kg（相當于人體臨床1 d劑量的10倍）灌胃橘皮竹茹湯凍干粉藥液，空白組按照10.0 mL/kg灌胃蒸餾水。給藥1 h后，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，取腹主動脈血，離心（3 000 r/min，10 min，離心半徑7 cm），取上清液，-80℃保存。

取大鼠空白血清及給藥血清各400 μL，各加入10 μL 磷酸，渦旋震蕩（2 500 r/min），分別加入 1.6 mL乙腈，渦旋震蕩（2 500 r/min），離心（13 000 r/min，4℃，10 min，離心半徑 7 cm），取上清液，氮氣流吹干，殘渣用200 μL甲醇復溶，渦旋震蕩（2 500 r/min，60 s），離心（13 000 r/min，4 ℃，10 min，離心半徑7 cm），取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.4 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），ACQUITY UPLC BEH C18VanGuard Pre-Column預柱（2.1mm×5mm，1.7μm），柱溫35℃，0.1%甲酸水為流動相A，0.1%甲酸乙腈為流動相 B，梯度洗脫（0～3 min，0%～5%B；3～10 min，5%～50%B；10～18 min，50%～100%B；18～18.1 min，100%～5%B；18.1～20 min，5%B），流速 0.3 mL/min，進樣量 5 μL。

2.5 質譜條件 質譜條件設置見表2。

表2 質譜條件

2.6 數據分析方法 將橘皮竹茹湯給藥血清和空白血清導入Peakview軟件，設置相關參數（Mass Errorr≤10；權重30%，Isotope≤10%；權重30%，Formula Finderscore＞70%）扣除空白血清成分干擾，將檢測到的其余離子與體外藥材提取液所檢測到化合物的保留時間、母離子精確質量數、同位素峰度比及二級質譜圖進行比較，相同則確認為橘皮竹茹湯凍干粉中的原型成分[7]。

運用MetabolitePilot 2.0.4軟件，導入前期推斷或鑒定的橘皮竹茹湯化學成分的結構式和總離子流圖，為每一個化學成分設置不同的Biotransformation parameters，選擇所有可能的Ⅰ、Ⅱ相代謝途徑，設 置 Generic ParametersPeak、Finding Strategy 和Compound-Specific Parameters，給藥血清的液質采集數據為sample，空白血清的液質采集數據為control進行分析[8-9]，最后結合軟件及相關文獻給出代謝物的保留時間及二級碎片，推斷可能的代謝物。

3 結果

3.1 橘皮竹茹湯UPLC-Q-TOF/MS色譜圖的采集 根據建立的橘皮竹茹湯血中移行成分分析方法，采用正、負離子模式采集橘皮竹茹湯凍干粉樣品、給藥血清和空白血清數據。正離子模式總離子流圖見圖1，負離子模式總離子流圖見圖2。

圖1 正離子模式下總離子流圖

圖2 負離子模式下總離子流圖

3.2 橘皮竹茹湯血中移行成分分析與鑒定 根據“2.6”項的分析方法，結合對照品比對及文獻報道[10-15]，鑒定出大鼠灌胃橘皮竹茹湯凍干粉后的血中移行成分41個，包括原型成分13個、代謝產物28個。見表3。

表3 橘皮竹茹湯凍干粉血中移行成分分析結果

續表3

續表3

3.3 主要色譜峰的質譜分析

3.3.1 原型成分的鑒定 本研究鑒定了原型成分13個，以化合物2和9說明推測過程。

化合物2：負離子模式下，化合物2在含藥血清總離子流圖的柚皮苷保留時間與樣品總離子流圖一致，二級質譜碎片一致，準分子離子峰m/z 579.175 7相對豐度較強，擁有共同二級碎片m/z 403.143 4、271.062 1、151.002 9 等。通過查詢相關成分的文獻[16]，推斷化合物2為柚皮苷。二級質譜圖見圖3，其可能的裂解過程見圖4。

圖3 柚皮苷負離子模式下的質譜圖

圖4 推測的柚皮苷裂解途徑

化合物9：正離子模式下，化合物9在含藥血清總離子流圖與樣品總離子流圖甘草酸的保留時間一致，二級質譜碎片一致，準分子離子峰m/z 823.409 4相對豐度較強，擁有共同二級碎片m/z 647.377 3、471.344 9、369.236 9 等。通過查詢相關成分的文獻[17]，推斷化合物9為甘草酸。二級質譜圖見圖5，其可能的裂解過程見圖6。

圖5 甘草酸正離子模式下的質譜圖

圖6 推測的甘草酸裂解途徑

3.3.2 代謝產物的鑒定 本研究推測了28個代謝產物，以化合物20和化合物37為例說明鑒定過程。

化合物20：刺芒柄花素是來自甘草的黃酮類成分，易發生Ⅱ相代謝反應。通過MetabolitePilot代謝軟件分析發現，化合物20為刺芒柄花素A環7位發生葡萄糖醛酸化的產物。該產物在負離子模式下，準分子離子峰m/z 443.101 7[M-H]-，比刺芒柄花

素準分子離子峰m/z 267.065 9[M-H]-多176.035 8，符合1分子葡萄糖醛酸的分子量。結合其特征碎片m/z 267.065 9、252.042 9、223.042 1 等，與刺芒柄花素的二級碎片相一致，符合其葡萄糖醛酸化的過程。結合文獻報道[18]，芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖經Ⅰ相代謝水解反應后，轉化為芒柄花素，易發生

葡萄糖醛酸化反應。二級質譜圖見圖7，其可能的裂解過程見圖8。

圖7 刺芒柄花素葡萄糖醛酸化產物負離子模式下的質譜圖

圖8 推測的刺芒柄花素葡萄糖醛酸化產物裂解途徑

化合物37：柚皮黃素是陳皮中的黃酮類成分，易發生Ⅰ相代謝反應。通過MetabolitePilot代謝軟件分析發現，化合物37為柚皮黃素C環3位脫羥基產物。在正離子模式下，準分子離子峰為m/z 403.136 7[M+H]+比柚皮黃素準分子離子峰m/z 419.148 2[M+H]+少16，提示失去1個氧原子，發生脫羥基。結合二級質譜碎片離子 m/z 388.110 6、373.091 8、345.089 1等，與柚皮黃素的二級質譜碎片相比較，符合脫羥基過程。其準分子離子峰m/z 401.367 3丟失甲基產生m/z 388.110 6碎片離子，繼續丟失C環上的1分子一氧化碳和1個氧原子產生m/z 345.089 1碎片離子。另一條裂解途徑為A環甲氧基丟失，同時導致C環C-O鍵斷裂產生m/z 373.091 8碎片離子，m/z 373.091 8碎片離子丟失亞甲基產生m/z 359.114 6碎片離子。根據文獻報道[19]，該柚皮黃素脫羥基產物與川陳皮素的裂解規律一致，所以推測柚皮黃素脫羥基產物為川陳皮素。二級質譜圖見圖9，其可能的裂解過程見圖10。

圖9 柚皮黃素脫羥基產物正離子模式下的質譜圖

圖10 推測的柚皮黃素脫羥基產物裂解途徑

4 討論

本實驗考察了不同給藥劑量（1、5和10倍），結果顯示，10倍給藥劑量的響應值最高，色譜峰最多，故10倍是最佳給藥劑量。考察了4種血清處理方法（乙腈沉淀法、甲醇沉淀法、固相萃取-乙腈洗脫和固相萃取-甲醇洗脫），結果顯示，乙腈沉淀法是血中移行成分最多的一種方法，故乙腈沉淀法是血清最佳處理方法。考察了8個不同采血時間節點（0、0.5、1、2、4、8、12、24 h），結果顯示，給藥 1 h 檢測到的峰數目最多，故最佳采血時間節點為給藥后1h。

本實驗對大鼠進行灌胃給予橘皮竹茹湯凍干粉的含藥血清，推斷了41個血中移行成分，其中原型成分13個、代謝產物28個，來自陳皮的主要是黃酮類成分，包括橙皮苷、柚皮黃素等，能夠清除羥自由基、保護膜損傷、抑制幽門螺桿菌增殖、抗炎及增強幽門泵活動促進胃排空[20]。來自甘草的主要是黃酮類和三萜類成分，甘草中的甘草次酸能夠抑制幽門螺桿菌感染后的胃黏膜上皮細胞凋亡，發揮抗炎作用[21]。來自生姜的主要是姜辣素類成分，包括6-姜酚、6-姜烯酚等，能夠抑制胃黏膜上5-羥色胺3（5-HT3）和5-羥色胺4（5-HT4）受體發揮止吐作用[22]。結合各味藥物的傳統藥效及藥理作用，初步推測本實驗得到的41個入血成分可能是其發揮藥效的物質基礎。