何首烏提取物二苯乙烯苷對血管性癡呆模型大鼠內質網應激相關蛋白的影響*

袁茵 ，周天 ，張妍妍 ，鞠愛霞 ，肖洪彬 ，韓玉生

（1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江省龍科種業集團有限公司，哈爾濱 150040）

血管性癡呆（VD）是由各種腦血管疾病或長期慢性腦低灌注引起的神經功能異常綜合征，臨床上早期主要表現為血管性認知功能障礙，并逐漸向癡呆轉化[1]。研究發現，VD發病機制與內質網（ER）應激（ERS）關系密切，通過引起神經元過度自噬和凋亡，進而引起認知功能障礙[2-3]，因此調節神經細胞的自噬水平以及抑制其凋亡是防治VD的重要途徑之一[4]。現代藥理研究表明，中藥何首烏提取物二苯乙烯苷（TSG）對神經系統疾病具有良好的治療作用[5]。TSG能夠通過減少淀粉樣前體蛋白生成、抑制β淀粉樣蛋白的神經毒性、調節凋亡相關蛋白表達，從而抑制神經元凋亡[6]，還可以通過抑制環磷酸腺苷依賴性蛋白激酶A活化，減少細胞內的鈣離子（Ca2+），從而提高VD大鼠的學習記憶能力[7]。但目前對于TSG的研究主要集中在阿爾茲海默病（AD）的治療，而對于VD的研究較少，且作用機制尚不十分明確。本研究采用改良的雙側頸總動脈結扎（BCCAO）法制備VD模型大鼠，通過給予不同劑量TSG進行干預，從ERS角度探討何首烏提取物TSG對VD大鼠的保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質量（200±20）g，由青島市實驗動物和動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（魯）2016-0002。適應性飼養1周，經Morris水迷宮篩選合格的大鼠納入實驗。

1.2 主要試劑 TSG購自中國藥品生物制品鑒定所，純度>95%。兔抗GRP78（bs-1219R）、轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白（C/EBP）同源蛋白（CHOP，bs-1361R）、磷酸化蛋白激酶R樣ER激酶（p-PERK，bs-3330R）、磷酸化真核細胞起始因子2α（p-eIF2α，bs-3488R）、激活轉錄因子 4（ATF4，bs-1531R）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2，bs-20352R）、Bcl-2相關X蛋白（Bax，bs-0127R）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，bs-0081R）一抗由北京博奧森生物公司提供；二抗Anti-mouse IgG及二抗Antirabbit IgG由碧云天生物技術有限公司提供；PV二步法試劑盒由北京中杉生物公司提供。

1.3 模型制備和分組給藥 采用BCCAO法制備VD模型大鼠[8]。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（35 mg/kg）進行麻醉，仰臥固定，頸部正中備皮后常規消毒。沿頸部正中切口，鈍性剝離出左右側頸總動脈，用動脈夾閉血管20min，然后恢復血流10min，再次夾閉血管20 min，如此重復3次。第3次血流恢復后結扎兩側頸總動脈，清理并縫合傷口，局部注射慶大霉素0.2萬單位。

術后7 d進行Morris水迷宮篩選，將合格的大鼠隨機分為模型組（Model組）、TSG干預組，另設假手術組（Sham組）。TSG組在大鼠模型制備成功4周后分別按30 mg/kg和60 mg/kg劑量灌胃給藥，每日1次，連續給藥4周。同時Sham組和Model組大鼠分別灌胃給予等體積的生理鹽水。Sham組大鼠除不夾閉和結扎兩側頸總動脈外，余下處理方法同Model組大鼠。

1.4 Morris水迷宮行為學檢測 各組大鼠分別在術后第4、8周采用Morris水迷宮進行定位航行實驗和空間探索實驗。

1.4.1 定位航行實驗 將大鼠面對池壁緩慢地從某一象限中點放入池中，使大鼠每日進行4次訓練，連續訓練5 d，記錄大鼠在90 s內找到隱藏平臺的時間。如果大鼠不能在90 s內找到隱藏平臺，則由研究人員引導大鼠至平臺處，并允許大鼠在平臺停留15 s，以第5天的逃避潛伏期評價大鼠的空間學習能力。

1.4.2 空間探索實驗 在實驗第6天撤除隱藏平臺，將各組大鼠面對池壁緩慢放入水池后，記錄120 s內大鼠跨越平臺次數，以此評價大鼠的空間記憶能力。

1.5 蘇木素-伊紅（HE）染色 對各組大鼠腦組織進行染色觀察，在術后第8周時處死大鼠并迅速取出腦組織，經4%多聚甲醛固定后，脫水、透明、浸蠟和包埋，制備成5 μm切片后進行HE染色，顯微鏡下觀察海馬組織病理形態學變化。

1.6 免疫組化（IHC）染色 各組大鼠在術后第8周時處死并取腦組織，4%多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋，制備成5 μm切片，免疫組化PV二步法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達，每例選擇3個200倍視野，采用Image-pro plus 6.0病理圖像分析系統對陽性表達進行分析，取其平均值，以積分光密度（IOD值）代表蛋白相對表達量。

1.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測 取大鼠海馬組織加入預冷的RIPA裂解液中，超聲粉碎后經4℃離心機12000r/min離心10min（離心半徑10cm），取上清液，用二喹啉甲酸（BCA）法測定并調整蛋白濃度。上樣量為50 μg，經過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行凝膠電泳、轉膜、封閉和洗膜后，加入一抗（稀釋比例1∶1 000），4℃孵育過夜；洗膜后加入二抗辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白G單克隆抗體（IgG-HRP，稀釋比例1∶5 000）室溫孵育 1 h；洗膜后使用電化學發光（ECL）法檢測并拍照。以β-actin為內參，使用ImageJ分析軟件計算各組海馬組織中葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、CHOP、p-PERK、p-eIF2α 和ATF4蛋白表達。

1.8 統計學方法 實驗數據采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，結果以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布且方差齊時采用單因素方差分析，不符合時采用非參數檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSG對VD大鼠學習記憶障礙的改善作用 Morris水迷宮實驗顯示，在術后第4周時，Model組、TSG30組和TSG60組大鼠的逃避潛伏期比Sham組明顯延長，穿越平臺次數明顯減少（P＜0.05）。在術后第8周時，Model組大鼠的逃避潛伏期比Sham組明顯延長，穿越平臺次數明顯減少，經TSG干預治療后，TSG30組和TSG60組大鼠的逃避潛伏期比Model組明顯縮短，穿越平臺次數明顯增加，尤以TSG60組改善更加明顯（P＜0.05）。見表1及圖1。

表1 各組大鼠各時間節點逃避潛伏期及穿越平臺次數（±s）

表1 各組大鼠各時間節點逃避潛伏期及穿越平臺次數（±s）

注：同一時間節點與Sham組比較，*P＜0.05；同一時間節點與Model組比較，#P＜0.05。

次數（次） 潛伏期（s） 穿越平臺次數（次）Sham 組 6 24.83± 3.72 7.83±2.11 25.17± 3.89 7.83±1.57 Model組 6 75.34±13.47*3.33±1.21*74.84±11.96*3.43±1.51*TSG30 組 6 77.67± 8.79*3.67±1.03*58.16± 8.45#5.34±1.03#TSG60 組 6 76.82± 8.48*3.51±1.05*50.51± 9.82#5.67±1.21#組別 動物數術后4周 術后8周潛伏期（s） 穿越平臺

圖1 各組大鼠Morris水迷宮

2.2 TSG對VD大鼠海馬組織CA1區病理形態學的影響 HE染色結果顯示，Sham組大鼠海馬區神經細胞的形態比較規整，細胞質與細胞核界限清晰，染色均勻，神經元排列緊密，無組織充血、水腫和炎性細胞浸潤。與Sham組比較，Model組大鼠海馬區神經細胞排列紊亂，部分神經元細胞核固縮或細胞質深染，海馬區腦組織毛細血管擴張，結構疏松，可見小膠質細胞明顯增多和炎性細胞浸潤。與Model組比較，TSG30組和TSG60組大鼠海馬區病理表現有不同程度改善，表現為神經元形態明顯改善，毛細血管擴張和水腫減輕，小膠質細胞和炎性細胞數量明顯減少，以TSG60組改善更為明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區腦組織病理情況（HE，×400）

2.3 TSG對VD大鼠海馬組織CA1區凋亡相關蛋白表達的影響 IHC法檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠海馬組織中Caspase-3和Bax蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達明顯減少（P＜0.05）。與Model組比較，TSG30組和TSG60組大鼠海馬組織中Caspase-3和Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。見表2及圖3-5。

表2 各組大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較（±s）

注：與 Sham 組比較，*P＜0.05；與 Model組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 Bcl-2 Bax Caspase-3 Sham 組 6 3 171.74±468.95 2 219.69±190.41 1 985.89±181.28 Model組 6 2 311.61±256.72*2 881.53±197.44*2 532.78±155.42*TSG30 組 6 2 798.78±140.28#2 526.21±133.56#2 246.07±216.23#TSG60 組 6 2 845.64±133.05#2 405.67±177.14#2 195.73±176.46#

圖3 各組大鼠海馬CA1區Bcl-2蛋白表達情況（IHC，×400）

圖4 各組大鼠海馬CA1區Bax蛋白表達情況（IHC，×400）

圖5 各組大鼠海馬CA1區Caspase-3蛋白表達情況（IHC，×400）

2.4 TSG對VD大鼠海馬組織中ERS相關蛋白表達的影響 Western Blot法檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠海馬組織中GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α和ATF4蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。與Model組比較，TSG30組和TSG60組大鼠海馬組織中 GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α 和 ATF4 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見表3及圖6。

表3 TSG對VD大鼠海馬組織中GRP78、CHOP、p-PERK、p-elF2α 和 ATF4蛋白表達的影響（±s）

表3 TSG對VD大鼠海馬組織中GRP78、CHOP、p-PERK、p-elF2α 和 ATF4蛋白表達的影響（±s）

注：與 Sham 組比較，*P＜0.05；與 Model組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 GRP78 CHOP p-PERK p-eIF2α ATF4 Sham 組 6 0.28±0.03 0.32±0.03 0.38±0.02 0.76±0.05 0.45±0.04 Model組 6 0.64±0.02*0.68±0.04*1.03±0.06*1.45±0.09*1.08±0.06*TSG30 組 6 0.47±0.06#0.58±0.05#0.75±0.03#1.11±0.04#0.48±0.07#TSG60 組 6 0.41±0.03#0.54±0.02#0.74±0.02#1.01±0.06#0.51±0.05#

圖6 TSG對VD大鼠海馬組織中GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α和ATF4蛋白表達的影響

3 討論

研究表明，除AD外，VD是癡呆的第2大常見類型，其由腦部缺血、出血及缺氧等多種腦血管因素誘導，進而形成以認知功能障礙為主的綜合征[9]。VD病理機制尚不十分明確，同時臨床上缺乏有效的治療藥物，因此如何有效地控制VD的發生發展已成為眾多研究者關注的焦點。中藥何首烏是蓼科植物何首烏Polygonummultiflorum Thunb.的干燥塊根，藥性苦、甘、澀，微溫，歸肝、心、腎經，具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨、化濁降脂之功。何首烏的主要有效成分包括蒽醌類、TSG類、黃酮類和類酚類等。其中，TSG是何首烏中具有良好藥理活性的水溶性有效成分。現代藥理研究表明，TSG對神經細胞具有明顯的保護作用[10]，其機制與清除自由基、提高海馬組織微循環再灌注、促進腦室下區（SVZ）神經細胞增殖、調節5-羥色胺（5-HT）受體等方面有關，從而改善大鼠的學習記憶能力，發揮治療VD的作用[11-13]。本實驗研究結果表明，TSG能夠明顯縮短VD大鼠逃避潛伏期，增加穿越平臺次數，對VD大鼠學習記憶能力具有明顯的改善作用。同時TSG能夠減輕VD模型大鼠海馬組織病理損傷，起到神經保護的作用。

VD的發病機制復雜且尚不明確，ERS參與了認知功能的損害，對VD發生與發展發揮著重要的作用。研究表明VD模型中的學習記憶障礙與長期持續性的ERS呈高度相關[14-15]。ER是真核細胞中一種重要的細胞器，可以通過對蛋白質修飾、脂類合成和Ca2+轉運來維持細胞內環境的穩定。蛋白質的修飾過程主要有蛋白質折疊、糖基化以及二硫鍵的生成等[16]。研究表明ERS參與了細胞凋亡的發生發展[17]，其中未折疊蛋白反應（UPR）起著十分重要的作用。當一些外界刺激引起細胞的營養缺乏、DNA損傷、能量紊亂和氧化應激等時，打破細胞的內環境穩態，從而引起ERS[18]。在早期一定程度的ERS可以激活細胞的自身保護性適應機制，過強或持續性的ERS將導致ER內環境穩態無法修復，繼而導致UPR的爆發，最終引起細胞凋亡的發生[19-20]。

UPR主要通過ER跨膜蛋白肌醇需求酶1α（IRE1α）、蛋白激酶R樣ER激酶（PERK）和激活轉錄因子6（ATF6）3種ER跨膜蛋白來發揮作用。GRP78是ERS發生的標志性蛋白，在未發生ERS時，GRP78與 IRE1α、PERK、ATF6蛋白在 ER 內結合，這時處于無活性狀態。當發生ERS時，GRP78與3種跨膜蛋白分離，與錯誤折疊蛋白結合，從而使3種跨膜蛋白進入活化狀態，減弱致病因素對細胞的刺激[21]。當發生ERS時，通過被激活的IRE1α、PERK和ATF6途徑均可使CHOP的表達大量增加，其中PERK-eIF2α-ATF4途徑起主導作用，CHOP是ATF4的直接作用靶點。PERK與GRP78分離后活化，使eIF2α磷酸化，抑制eIF2β的活性，下調蛋白質合成，從而減輕ER的負荷[22-23]。同時peIF2α使ATF4合成增加，促進CHOP表達，進而使Bax、Caspase-3蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，最終導致細胞死亡[23]。

本實驗結果顯示，Model組大鼠海馬組織中Caspase-3和Bax蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達明顯減少，說明VD大鼠海馬組織神經細胞發生了凋亡。經過TSG干預后，大鼠海馬組織中Caspase-3和Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯增加，表明TSG對VD大鼠海馬組織中神經細胞凋亡具有抑制作用。Model組大鼠海馬組織中GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α 和 ATF4 蛋白表達明顯增加，表明在VD的發生發展過程中有ERS發生。經過TSG干預后，海馬組織中GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α和ATF4蛋白表達明顯降低，表明TSG對VD模型ERS相關蛋白具有一定的調控作用。綜上所述，ERS參與了VD發生發展過程，何首烏提取物TSG可能通過調控ERS相關蛋白表達，抑制神經細胞凋亡，從而改善VD大鼠學習記憶障礙。