食品中志賀氏菌屬的測定能力驗證結果分析

◎ 王麗杰，何麗萍，楊曉暉，張明新

(河南中測技術檢測服務有限公司，河南 鄭州 450000）

志賀氏菌，又稱痢疾桿菌，為革蘭氏陰性桿菌，也是人類細菌性痢疾最常見的病原菌[1]。它不但可以通過食物和水源傳播、也可通過糞口傳播和接觸傳播，是重要的食源性致病菌之一。據調查，全球每年約有1.6億人感染志賀氏菌，大約有110萬人死亡，其中絕大多數是兒童[2]。在發達國家，最常見的是宋內氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌[3-4]，志賀氏菌在我國分布廣泛，其中以福氏志賀氏菌和宋內氏志賀氏菌最為常見。志賀氏菌能夠污染包括蔬菜、肉類、蛋制品和奶制品在內的很多食物，它能分泌內、外毒素，以較低的感染劑量使疾病得到有效的傳播，可引起腹痛、腹瀉、里急后重、結腸水腫和潰瘍等癥狀[5-6]。

目前，志賀氏菌的檢測有傳統的檢測方法，如國家標準法[7]、免疫學檢測方法等。常規的國標方法檢驗志賀氏菌，在增菌和選擇性培養后，再用生化試劑鑒定和血清學分型，往往需要數天的時間來得到檢測結果[8]。隨著分子生物學的發展，恒溫擴增熒光技術因儀器簡單、操作簡單、使用便捷、特異性高和快速判讀等特點，被廣泛應用于微生物檢測中。

能力驗證是利用實驗室間比對，按照預先制訂的準則評價參加者的能力。當有的量值溯源尚難實現或無法實現時，可利用能力驗證來表明測量結果的可信性。為監督評估本檢測機構人員檢測志賀氏菌屬的能力，提高檢測質量，故參加志賀氏菌屬定性檢測的能力驗證。

1 材料與方法

1.1 樣品和標準菌株

志賀氏菌屬能力驗證檢測樣品3個，編號為CFAPA-1192-101、CFAPA-1192-446和CFAPA-1192-068，均為西林瓶真空密封包裝的白色粉狀樣品。標記為M1、M2、M3。本次能力驗證，由大連中食國實檢測技術有限公司組織實施。福氏志賀氏菌標準菌株（CMCC（B）51572）作為陽性對照菌株。

1.2 培養基及試劑

志賀氏菌增菌肉湯、志賀氏菌顯色培養基、營養瓊脂（NA）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、麥康凱瓊脂（MAC）、三糖鐵瓊脂（TSI）、Kovacs氏靛基質試劑盒（Kovacs’s indole kit）、HBI志賀氏菌生化鑒定條、血清和志賀氏菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）。

1.3 儀器與設備

YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；BSC-1500IIA2-X生物安全柜（濟南鑫貝西生物）；SPX-250B-Z生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；7L厭氧盒（日本三菱）；Deaou-308C恒溫擴增熒光檢測系統（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.4 檢測方法

按照國家檢測標準GB 4789.5—2012檢測步驟對能力驗證樣品進行檢測，同時用恒溫擴增熒光法作為輔助檢測方法，進行結果比對。對篩選出疑似菌落，采用恒溫擴增熒光法進行鑒定。同時以福氏志賀氏菌標準菌株（CMCC(B)51572）為陽性對照用菌。

1.4.1 GB 4789.5—2012方法檢測

（1）水化與預增菌。按照組織單位給定參試指導書再水化能力驗證樣品，參照國家標準GB 4789.5—2012，將上述檢樣轉移至盛有225 mL志賀氏菌增菌肉湯的無菌均質袋中，拍打混勻，于41.5 ℃厭氧培養16～20 h。同法操作將標準菌株接種培養。

（2）分離。各取一環增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD平板、志賀氏菌顯色培養基平板、MAC平板上，于36 ℃培養20～48 h，觀察各平板菌落生長形態。

（3）初步生化試驗。自上述平板上分別挑取3個典型及可疑菌落，分別接種TSI、半固體各一管，由于營養瓊脂無選擇性，可將挑取可疑菌落同時接種至志賀氏菌顯色平板和營養瓊脂平板上，增加選擇效果，置（36±1）℃培養箱培養20～24h，觀察培養結果。凡是TSI斜面產堿、底層產酸、不產硫化氫、不產氣（福氏志賀氏菌6型可產生少量氣體）及半固體管中無動力的菌株，挑取上述志賀氏菌顯色平皿純培養生長的菌苔，進行生化鑒定試驗和血清學試驗。

1.4.2 恒溫擴增熒光法

（1）制備DNA模板。增菌液DNA模板制備方法為取1.4.1中志賀氏增菌液1 mL置于1.5 mL無菌離心管中，12 000 r·min-1離心 2 min，棄上清液，加入 100 μL DNA提取液，混勻后將離心管放置于水浴鍋中，100 ℃加熱5 min，然后12 000 r·min-1離心2 min，取上清液作為DNA模板。單菌落DNA模板制備方法為在無菌PCR管中加入20 μL無菌水，后用無菌槍頭挑取1.4.1中NA平板上純培養的單菌落于PCR管中，用移液槍吹打，重懸混勻，然后置于PCR儀中，執行PCR程序95 ℃，10 min，待程序結束后取出，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液作為反應模板。

（2）恒溫擴增熒光法反應條件。參照志賀氏菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）的說明進行，具體操作步驟為在檢測界面分別點擊“請編寫試驗名稱”“項目名稱”完成編輯，編輯完后選取“反應時間”為45 min；將上述反應管放入儀器內，點擊“開始檢測”開始反應。

2 結果與分析

2.1 GB 4789.5—2012檢測結果

2.1.1 菌落形態特征

按照GB 4789.5—2012操作，分別取1環培養后的志賀氏菌增菌肉湯劃線接種于XLD平板、志賀氏菌顯色平板和MAC平板，培養后菌落形態特征如表1所示。結果表明，XLD干擾菌的菌落為黃色和無色有黑色中心菌落；MAC干擾菌的菌落為粉色菌落，與典型菌落特征容易區分；志賀氏菌顯色培養基干擾菌的菌落為綠色、黑色、無色有黑色中心菌落。

表1 選擇性分離平板上的菌落特征表

2.1.2 初步生化鑒定結果

觀察樣品及標準菌株在XLD、志賀氏菌顯色平板、MAC上的菌落形態特征，分別挑取3個可疑菌落在TSI斜面劃線后垂直穿刺，因生化鑒定試劑條配置斜面較小，生化現象易被掩蓋，所以TSI最好采用機構自己配置的高層斜面，接種針挑取分離后菌落，于斜面上劃線，再穿刺（穿刺針不要破壁，不要穿透，距底部5 mm左右即可），置于36 ℃培養箱培養20～24 h后，觀察實驗現象。同時挑取同一菌落劃線于志賀氏顯色平板與營養瓊脂平板進行純化，培養后挑取適量菌體，制備成0.5麥氏比濁的菌懸液，用HBI志賀氏菌生化鑒定條進行鑒定。樣品M1、M2、M3各挑選3個可疑菌落，標準菌株挑選1個，鑒定結果見表2。

表2 初步生化實驗、生化鑒定試劑條鑒定結果表

結 果 表 明 M1-1、M1-2、M1-3、M3-1、M3-2、M3-3在TSI斜面產酸、底層產酸、不產硫化氫以及產氣，初步判斷為非志賀氏菌屬。M2-1、M2-2、M2-3在TSI斜面產堿、底層產酸、不產硫化氫以及不產氣，初步判斷為可疑志賀氏菌屬。

2.1.3 生化鑒定試劑條鑒定結果

采用HBI志賀氏菌生化鑒定條對樣品M1、M2、M3的可疑菌落進行鑒定，結果見表2。TSI、半固體初步生化實驗及HBI志賀氏菌生化鑒定條實驗結果表明，樣品M2中檢出可疑性志賀氏菌屬，M1、M3中未檢出可疑志賀氏菌屬。

2.1.4 血清學試驗

按照GB 4789.5—2012操作，結果表明M2-1、M2-2、M2-3血清學凝集，其余血清學不凝集。根據2.1.3、2.1.4實驗結果，得出樣品M2中檢出志賀氏菌，M1、M3未檢出志賀氏菌。

2.2 恒溫擴增熒光法鑒定

挑取樣品在不同選擇性平板上的可疑單菌落按照1.4.2進行檢測。采用恒溫擴增熒光法鑒定，結果顯示M2以及標準菌株出現對數增長的S型曲線，表明志賀氏菌屬陽性檢出。M1、M3未出現熒光對數增長的S型曲線，表明志賀氏菌屬陰性未檢出。

3 結論

目前，GB 4789.5—2012是被檢測機構經常采用的志賀氏菌檢測方法，但根據志賀氏菌的生長及生化特性，國家標準檢測方法需要經過厭氧預增菌培養、分離純化、TSI半固體生化試驗、生化鑒定試劑條或生化鑒定系統鑒定，檢測完成需歷經8 d時間，檢測周期較長；而采用恒溫擴增熒光法檢測只需提供適宜的恒定溫度，檢測周期僅約20 h，簡單、高效、特異性強、快速且操作簡單。

能力驗證樣品M2在XLD及志賀氏顯色培養基上均出現無色帶黑色中心菌落，鑒定為沙門氏菌干擾菌落，如菌落形成較小時，菌落黑色中心未形成，容易誤判為無色菌落，因此，在分離純化時可挑取同一菌落同時分離劃線于志賀氏顯色平板及營養瓊脂平板，在志賀氏顯色平板上判定為純菌落及形態后，再從營養瓊脂上挑取菌落制備菌懸液。

實驗現象表明，GB 4789.5—2012中選擇性平板培養基上干擾菌的菌落形態特征與志賀氏菌的菌落形態特征相似，不易分辨，如果檢測人員經驗不足，容易造成漏篩，造成假陰性結果。另外，菌懸液制備不易把控，影響生化鑒定試驗結果，易造成假陽性結果，導致檢測結果判定錯誤，而恒溫擴增熒光法依據擴增曲線走向進行檢測結果的判定，不必選取可疑菌落，避免了漏篩或生化鑒定現象錯判的可能性，提高結果測定的準確度和可靠性。

以上實驗結果表明，本次檢測機構參加的志賀氏菌屬定性檢測的能力驗證結果為能力驗證樣品CFAPA-1192-446檢出志賀氏菌，樣品CFAPA-1192-101、CFAPA-1192-068未檢出志賀氏菌，取得“滿意”結果，驗證了本檢測機構志賀氏菌的檢測能力，確保實驗數據的準確性，為政府監督部門監督執法提供強有力技術支撐。恒溫擴增熒光法與GB 4789.5—2012檢測結果一致。恒溫擴增熒光法因儀器簡單、操作簡單、使用便捷、特異性高和快速判讀等特點，可作為志賀氏菌屬檢測驗證中的比對方法，兩種方法相互輔助驗證，大大提高了檢測結果的準確性。