貝類食品中腹瀉性貝類毒素檢測能力驗證結果分析

◎ 王運選，李春愛，黎 承，石 慧，肖文琳

（1.儋州市疾病預防控制中心，海南 儋州 571700；2.白沙黎族自治縣疾病預防控制中心，海南 白沙 572800；3.海南省疾病預防控制中心，海南 海口 570000）

腹瀉性貝類毒素是海洋生物毒素的一大類，是由微型赤潮藻類和微生物產生，被雙殼貝類濾食后富集在體內的天然活性物質[1]；腹瀉性貝類毒素是一類脂溶性物質，不溶于水，物理熱穩定性高，因被人體攝入后產生以腹瀉為主要癥狀的中毒現象而得名[2]。根據其化學結構主要分為6組，分別為大田軟海綿酸毒素組（Okadaic acid，OA）、原多甲藻酸毒素組（Azaspiracid，AZA）、短裸甲藻毒素組（Brevetoxin，BTX）、蛤毒素組（Pectenotoxin，PTX）、蝦夷扇貝毒素（Yessotoxin，YTX）組及環亞胺類毒素組（Cyclic imine，CI）[3]。近幾年，福建、廣東、浙江和河北等沿海地區頻繁出現貝類毒素中毒事件[4-5]，且我國是雙殼貝類養殖大國[6]，貝類毒素的污染已嚴重影響到出口貿易，加強對貝類毒素的監測力度，保證貝類食用安全是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料

質控樣品和質控匹配基質空白樣（陰）各2份，每份包裝均為3 g，采用鋁箔紙密封包裝，基質主要為貽貝，均來自于本次能力驗證承辦方深圳市疾病預防控制中心；本實驗室收到的質控樣品編號為02-F。

1.2 儀器和試劑

SCIEX TRIPLE QUADTM AB-5500液相-質譜聯用儀，美國SCIEX公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機，eppendorf公司；Multi Reax多管渦旋混合器，德國Heidolph公司；Mettler XS204型十萬分之一分析天平，美國Mettler Toledo公司；SCIENTZ-950E超聲波提取器，寧波新芝生物科技公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；0.22 μm有機相針式濾器，上海安譜科學儀器有限公司。

甲醇、乙腈，色譜純，德國Merck公司；氫氧化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸，優級純，廣州化學試劑廠；CNWBOND HC-C18SPE Cartridge固相萃取柱（200 mg，3 mL），安捷倫科技有限公司；Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×150 mm），沃特世科技有限公司；6種腹瀉性貝類毒素標準品，NRC·CNRC（見表1）。

表1 標準品信息標配表

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

分 別 準 確 吸 取 OA（8.40 μg·kg-1）、DTX1（8.50 μg·kg-1）、DTX2（3.80 μg·kg-1）、PTX2（4.40 μg·kg-1）、YTH（4.90 μg·kg-1） 和 HYTX（5.75 μg·kg-1）6 種 腹瀉性貝類毒素原液0.024 mL、0.024 mL、0.053 mL、0.046 mL、0.041 mL和0.035 mL，用甲醇定容至1.0 mL，分 別 得 到 濃 度 為 201.6 ng·mL-1、204.0 ng·mL-1、201.4 ng·mL-1、202.4 ng·mL-1、200.9 ng·mL-1和201.3 ng·mL-1的標準中間工作溶液，避光-20 ℃以下保存；將標準中間工作液用空白基質由濃度點逐級稀釋配制成系列標準工作曲線點。

1.3.2 樣品前處理

（1）稱取本樣品0.2 g于20 mL離心管中，加入1.8 mL水，完全溶解混勻后制成濕樣。在制成的濕樣中加入4 mL甲醇，渦旋混勻1 min，超聲5 min，振蕩提取20 min，8 000 r·min-1離心5 min。取上清液至20 mL玻璃刻度離心管中，殘渣再用4 mL甲醇重復提取1次，合并上清液，用甲醇定容至10 mL。

（2）游離態分析。取上述提取液，用孔徑為0.22 μm的有機濾膜過濾，用于測定游離態的腹瀉性貝類毒素。

（3）總量測定。當游離態的腹瀉性貝類毒素均未檢出時，不需測定總量。當至少有一種檢出時，需經過堿皂化后測定其總量。取1 mL上述提取液（相當于0.02 g樣品）于10 mL具塞試管中，加入2.5 mol·L-1氫氧化鈉溶液125 μL，混勻后加蓋密封，于76 ℃恒溫反應40 min。試管流水冷卻至室溫后，加入 2.5 mol·L-1鹽酸 125 μL 和水 2.5 mL，混勻，于8 000 r·min-1離心 5 min，上清液加到 C18固相萃取柱（事先依次用2 mL甲醇和2 mL水活化），待樣液流干后，用2 mL 20%甲醇水淋洗除雜，并棄去全部流出液，最后用1 mL含0.2%氨水的甲醇溶液洗脫待測物，用孔徑為0.22 μm的有機濾膜過濾，液質聯用儀測定。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×150 mm）色譜柱；柱溫：40 ℃；進樣量：5.0 μL；流速：0.3 mL·min-1；流動相：0.01%氨水-乙腈；梯度洗脫程序見表2中運行17.0 min的梯度。

表2 梯度洗脫程序表

1.4.2 質譜條件

離子源：H-ESI源，正/負離子模式；掃描模式：多反應監測（MRM）模式；噴霧電壓：3 500 kV；汽化溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；鞘氣（氮氣）流速：35 L·min-1；輔助氣（氮氣）流速：5 L·min-1；碰撞氣：高純氬氣，壓力為200 kPa。

1.5 數據處理

采用統計軟件Excel 2007和SCIEX TRIPLE QUADTM AB-5500液相色譜-質譜聯用儀配備的定量分析軟件對檢測結果進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線分析

本實驗室主要針對6種腹瀉性貝類毒素進行了檢測分析，由于實驗室采買的標準品混標中各型別的腹瀉性貝類毒素質量濃度不一致，用空白基質逐級稀釋時產生了有細微差別的質量濃度曲線點（表3）。在實驗分析過程中可知，腹瀉性貝類毒素OA、DTX1、DTX2、YHX、HYTX、PTX2的相關系數R分別為0.997 3、0.990 9、0999 8、0.998 7、0.999 8 和 1.000 0。

表3 標準曲線點配制表

2.2 加標實驗結果分析

本次實驗針對6種腹瀉性貝類毒素分別進行了低、中、高3種濃度的加標回收實驗，實驗結果如表4所示。加標所用基質均為組織單位提供的陰性標本，由表4可知，OA、DTX1、DTX2、YHX、HYTX和PTX2的加標回收范圍分別為72.0%～86.5%、74.7%～102.4%、67.2%～94.1%、39.4%～83.7%、89.9%～113.7%和79.5%～111.6%。

表4 加標實驗結果表

2.3 初測檢出項目分析

編號02-F的盲樣標本根據1.3.2中樣品前處理步驟進行提取測定，共檢出3種腹瀉性貝類毒素，經基質標準曲線校正結果得出OA含量初測結果為248.8 μg·kg-1、DTX1 含量初測結果為 215.8 μg·kg-1、DTX2含量初測結果為 198.9 μg·kg-1；由于實驗過程中經過固相萃取柱提取凈化產生折損，根據陰性樣品中平均加標回收率折算檢出物的真值，OA、DTX1、DTX2的平均回收率分別為85.0%、100.6%、84.2%，最終檢出物質的真值分別為 293 μg·kg-1、215 μg·kg-1、236 μg·kg-1；根據《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》（CNAS-GL002），采取穩健Z比分數法對各實驗室提交的貝類毒素檢測結果進行分析和評價，本實驗室在初測結果中獲得滿意。

2.4 檢測結果統計

全國共有25家疾病預防控制中心實驗室及相關檢測機構參加本次質控考核能力驗證，2021年2月完成初測提交結果，25家實驗室提供的結果中，1家實驗室結果不滿意，其余24家全部通過考核，其中22家實驗室初測滿意，占88.0%；2家實驗室復測滿意，占8.0%。筆者收錄了本實驗室所在組別的部分實驗室考核結果如表5所示。

表5 B組考核結果報告匯總表

3 結論與討論

3.1 提取溶劑的選擇

為獲得較高的質譜響應、較好的分離效果和較高的樣品回收率，本實驗室對比了純甲醇、80%甲醇溶[7]、50%甲醇溶液、丙酮4種溶劑的提取效。實驗測試表明，4種溶劑均能在一定程度上對目標組分進行提取分離，其中純甲醇、80%甲醇溶液和丙酮的提取效率能達到70%，考慮到后續可能存在二次提取的操作，丙酮的可操作性較差，故不推薦；且由于貝類樣品中含有豐富的蛋白質、脂肪等雜質[8]，純甲醇的提取效果更優，因此，本實驗室使用純甲醇作為提取溶劑。

3.2 色譜柱的選擇

由于6種腹瀉性貝類毒素中含有同分異構體或同系物，其化學性質相近，選擇合適的色譜柱能有效提高分離效率，減少干擾。本實驗室條件有限，只針對BEH C18和Atlantis C18進行了對比，Atlantis C18是一種親水相互作用色譜柱，提供與反相色譜柱互補的分離選擇性，但在實驗過程中發現，Atlantis C18分離的目標物峰形較寬，且部分毒素峰形拖尾，分離效果并不理想[9]；BEH C18能有效分離出6種腹瀉性貝類毒素，峰形陡峭尖銳，且同等梯度洗脫和質譜條件條件下，BEH C18能完全分離OA和DTX2兩種同分異構體，因此，本實驗室最終采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱。

3.3 樣品的基質效應

實驗過程中為驗證基質效應對測定結果的影響，實驗室采用組織單位提供的陰性樣品進行了低、中、高3種濃度的加標回收實驗，樣品采用甲醇提取后直接測定分析，通過與標準溶液測定結果校正發現，其低濃度的加標回收率基本為0%，中、高濃度的加標回收率低于30%；樣品提取液經過固相萃取柱凈化提取后二次測定，回收率稍有提升，但仍沒有達到實際加標量的60%[10]。這主要是因為貝類樣品中含有豐富的蛋白質、脂肪等雜質，其基質效應極強，在色譜分析過程中會造成干擾。由于本實驗采用外標法定量，在沒有內標同位素校正的情況下，采用陰性樣品基質來配制標準曲線，可以有效提高回收率，準確對待測樣品進行定量分析。

3.4 挑戰與待改進措施

由于筆者所在實驗室條件有限，樣品在檢出游離的OA、DTX1、DTX2這3種中任一種時，需要對樣品提取液進行堿皂化測定其總量；筆者并沒有對皂化過程進行優化或者選擇比較多種固相萃取柱的凈化效果，實驗效果仍待提升。