優(yōu)化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中酰胺醇類藥物殘留

◎ 林敏霞，徐媛原，鐘仕花

（廣東省深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518000）

近年來，食品安全問題受到高度關(guān)注，尤其水產(chǎn)品質(zhì)量安全的突發(fā)事件屢見不鮮[1]，多次出現(xiàn)因食用不合格水產(chǎn)品直接影響食用者身體健康、損害消費(fèi)者利益的事件。在水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物中，酰胺醇類藥物較為普遍。

目前，水產(chǎn)品中酰胺醇類的檢測(cè)方法有氣質(zhì)聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）[2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS-MS）[3]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS-MS）[4]。 本試驗(yàn)通過優(yōu)化前處理方法，改良提取步驟，有效節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和試劑耗材，通過實(shí)際樣品的檢測(cè)驗(yàn)證，能基本滿足水產(chǎn)品中酰胺醇類殘留大批量樣本的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚，購(gòu)買于某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；氯霉素（CAP，99.24%）、甲砜霉素（TAP，99.99%）、氟苯尼考（FF，99.27%）和氯霉素氘代物（CAP-D5，100 μg·mL-1），均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、乙腈、甲酸和甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；無水硫酸鈉和正己烷（分析純）；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

采用AB SCIEX公司生產(chǎn)的QTRAP 5500 LC-MS/MS三重四級(jí)桿質(zhì)譜設(shè)備；百分之一電子天平（賽多利斯公司）；XS105DU十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO公司）；多管渦旋混合儀（杭州奧盛儀器公司）；德國(guó)SIGMR公司5810R高速冷凍離心機(jī)；N-evap 24氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；Milli-Q Advamtage超純水器（Millipore公司）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制。分別精密稱量經(jīng)純度折算相當(dāng)于10 mg（精確至0.01 mg）的氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素，置于10.0 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，制備成100 mg·L-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，并避光保存至-18 ℃。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制。準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成濃度為1.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（3）基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制。準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入5份空白樣品，同1.3.2處理配制成系列基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配

（4）CAP-D5內(nèi)標(biāo)工作液配制。準(zhǔn)確吸取適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，配成濃度為0.1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3.2 樣品前處理方法

（1）優(yōu)化前的試驗(yàn)過程參照《可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20756—2006）進(jìn)行操作。分別取6份已知陰性生鮮羅非魚樣品進(jìn)行加標(biāo)，氯霉素加標(biāo)量均為 0.10 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1和1.00 μg·kg-13個(gè)濃度，甲砜霉素和氟苯尼考加標(biāo)量均為 1.00 μg·kg-1、2.00 μg·kg-1和 4.00 μg·kg-13 個(gè)濃度，并在檢測(cè)的過程中以GB/T 20756—2006為主要的處理標(biāo)準(zhǔn)。

（2）優(yōu)化后的試驗(yàn)過程按照以下步驟處理。在50 mL離心管中仔細(xì)稱取5.00 g勻漿樣品，在內(nèi)標(biāo)工作液中加入適量的D5-CAP溶液，最后測(cè)定內(nèi)標(biāo)濃度為 1.00 μg·kg-1，氯霉素加標(biāo)量均為 0.10 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1和 1.00 μg·kg-13 個(gè) 濃 度， 甲 砜 霉 素 和氟 苯 尼 考 加 標(biāo) 量 均 為 1.00 μg·kg-1、2.00 μg·kg-1和4.00 μg·kg-13個(gè)濃度。加入10 mL酸化乙腈，用多管渦旋混合儀2 500 r·min-1渦旋振蕩5 min，充分提取并除雜。以9 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液4 mL于15 mL離心管中，35 ℃水浴氮吹近干，用20%乙腈水1 mL進(jìn)行定容，1 500 r·min-1渦旋振蕩3 min，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。C18色譜柱：2.1 mm×50 mm ，1.7 μm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜條件。電離模式：ESI；掃描方式：正/負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Response Monitoring，MRM），離子化電壓：5 500 V（正離子模式），-4 500 V（負(fù)離子模式）；霧化器壓力和輔助氣氣壓：379.2 kPa；氣簾氣壓力：68.9 kPa；離子源溫度：550 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

本試驗(yàn)比較了以乙腈和乙酸乙酯為萃取劑時(shí)對(duì)萃取效果的影響，試驗(yàn)表明，使用乙腈作為萃取溶劑時(shí)，萃取效果優(yōu)于乙酸乙酯。因此，在本試驗(yàn)中，選擇乙腈作為萃取溶劑。

2.2 流動(dòng)相的選擇

為了保證酰胺醇類藥物在分離過程中取得良好的分離效果，本文選取了乙腈-水[5]、甲醇-乙酸銨溶液2種不同的流動(dòng)相體系進(jìn)行對(duì)比。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈-水（圖1）作為流動(dòng)相時(shí)的信號(hào)響應(yīng)值較甲醇-乙酸銨（圖2）溶液作為流動(dòng)相時(shí)高，因此選擇乙腈-水作為流動(dòng)相。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

本試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)組分在0.10～6.00 μg·kg-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，3種目標(biāo)組分相關(guān)系數(shù)均大于0.999。氯霉素的回歸方程y=1.336 08x（r=0.999 6），甲砜霉素的回歸方程y=0.409 48x（r=0.999 0），氟苯尼考的回歸方程y=1.332 14x（r=0.999 6）。在選定的色譜和質(zhì)譜條件下，檢測(cè)限（LOD）是信噪比（S/N）的3倍，定量限（LOQ）是信噪比（S/N）的10倍。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)[6]要求的檢出限（0.1 μg·kg-1和 1.0 μg·kg-1），3 種目標(biāo)組分的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）見表2。

表2 3種酰胺醇類的檢出限和定量限結(jié)果表

2.4 精密度和回收率試驗(yàn)

分別向空白羅非魚中添加 0.10 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1和 1.00 μg·kg-13 個(gè) 濃 度 的 氯 霉 素 和 1.00 μg·kg-1、2.00 μg·kg-1和 4.00 μg·kg-13 個(gè) 濃 度 的 甲 砜 霉 素 和標(biāo)準(zhǔn)氟苯尼考溶液，以進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表3。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率分別為85.6%～90.7%、83.2%～89.4%、85.3%～93.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～9.9%。

表3 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)結(jié)果表

2.5 優(yōu)化后的方法檢測(cè)實(shí)際樣品

用優(yōu)化后的方法檢測(cè)了10個(gè)氯霉素陽性水產(chǎn)品樣本，包括花甲、蟶子、沙白、扇貝和沙甲。檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際陽性水產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了《可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20756—2006）方法。該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，大大縮短了初始處理時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。方法的定量限為0.011 ～ 0.066 μg·kg-1，回收率為 83.2% ～ 93.6%。本方法適用于大量水產(chǎn)品中酰胺醇?xì)埩袅康臏y(cè)定。