臭氧預(yù)處理對(duì)老年兔心臟再灌注心律失常的影響及其作用機(jī)制

王芮 黃浦茜丹 張雨 關(guān)圓 張東亞

(1清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100084；2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心麻醉科；3清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科)

冠心病是臨床老年患者最為常見的一種心腦血管類疾病，體外循環(huán)下行冠脈搭橋手術(shù)是目前一種比較成熟的治療方式，但是體外循環(huán)導(dǎo)致的心臟功能障礙嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。心肌缺血-再灌注損傷(MIRI)是體外循環(huán)過程中發(fā)生心臟功能障礙的主要原因，嚴(yán)重的室性心律失常是MIRI的重要表現(xiàn)〔1〕。研究表明引起再灌注損傷的重要生理基礎(chǔ)是炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激〔2〕，臭氧(O3)是一種活性氧，適量的臭氧處理有利于維持機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)，從而對(duì)發(fā)生MIRI的臟器產(chǎn)生保護(hù)作用〔3〕。但O3預(yù)處理是否可以降低再灌注心律失常(RA)的發(fā)生及其作用機(jī)制尚不清楚，本研究在老年兔離體心臟缺血-再灌注模型的基礎(chǔ)上研究O3預(yù)處理對(duì)再灌注心律失常的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑 Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)(成都儀器廠)，臭氧機(jī)(德國(guó)卡特公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC，北京諾博萊德公司)，IL-6、IL-10試劑盒(上海酶聯(lián)公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)已獲得清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審核委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：RECLA18-01)。健康老年新西蘭白兔(30月齡)，雌雄不拘(由清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組和預(yù)處理 24只老年新西蘭白兔隨機(jī)分為正常對(duì)照(C)組，缺血-再灌注(IR)組，O3預(yù)處理(O3P)組。C組和IR組術(shù)前5 d，常規(guī)飼養(yǎng)。O3P組術(shù)前5 d，每天上午9：00～11：00腹腔注射40 μg/ml O310 ml。

1.3.2Langendroff離體心臟灌注模型制備 術(shù)前30 min經(jīng)兔耳緣靜脈注射肝素400 IU/kg。耳緣靜脈注射2.3%戊巴比妥鈉注射液30 mg/kg實(shí)施麻醉，經(jīng)肋弓下角切口至胸骨角暴露心臟，用顯微手術(shù)鑷夾于主動(dòng)脈弓三大分支根部，迅速離斷主動(dòng)脈、肺動(dòng)靜脈和上下腔靜脈。離斷血管后，立即將心臟置于4℃的K-H灌注液(NaCl：13.84 g，NaHCO34.2 g，KCl 0.70 g，KH2PO40.32 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，葡萄糖4.0 g，CaCl20.40 g，蒸餾水 2 000 ml，pH 7.35～7.45)中，使其停搏以減少心肌缺血損傷并擠出離體心臟內(nèi)殘留的血液。迅速將主動(dòng)脈根部懸掛于Langendorff灌注裝置上，用K-H灌注夜(95%O2-5%CO2混合氣體預(yù)充飽和)灌流，灌注溫度37℃，灌注壓80 mmHg。剪開左心耳，將與壓力換能器連接的自制乳膠球囊經(jīng)切開處置入左室，調(diào)節(jié)球囊內(nèi)液體量，使左室舒張末壓(LVEDP)維持在0～10 mmHg。將三個(gè)電極針分別置于心尖、左心耳、主動(dòng)脈弓處的心外膜上，記錄心電圖〔4〕。

1.3.3全MIRI模型 在離體兔心臟恒流逆行灌注的基礎(chǔ)上，用95%O2和5%CO2混合氣體飽和后的K-H灌注液平衡灌注后，關(guān)閉蠕動(dòng)泵停止灌注即為全心缺血，打開蠕動(dòng)泵灌注即為恢復(fù)再灌注〔5〕。本實(shí)驗(yàn)兔心臟均進(jìn)行平衡20 min，缺血30 min，再灌注60 min。

1.3.4心臟血流動(dòng)力學(xué)和心電圖指標(biāo)監(jiān)測(cè) 于平衡20 min(T0)、再灌注60 min(T1)時(shí)記錄左室收縮峰壓(LVSP)和LVEDP。計(jì)算左室舒張壓(LVDP)=LVSP-LVEDP。記錄各組離體家兔心臟再灌注期間室性心律失常(包括室性心動(dòng)過速和心室顫動(dòng))的發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間，圖示為實(shí)驗(yàn)過程中的記錄的心電圖(圖1)。心律失常評(píng)分采用Curtis-Walker評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔6〕：0分為室性早搏0～49次、1分為室性早搏50～499次、2分為室性早搏>500次和(或)1次可恢復(fù)性室性心動(dòng)過速和(或)室顫、3分為超過1次的可恢復(fù)性室性心動(dòng)過速和(或)心室顫動(dòng)(持續(xù)時(shí)間<60 s)、4分為室性心動(dòng)過速和(或)心室顫動(dòng)(總持續(xù)時(shí)間60～119 s)、5分為室性心動(dòng)過速和(或)心室顫動(dòng)(總持續(xù)時(shí)間>119 s)、6分為再灌注15 min后出現(xiàn)致死性心室顫動(dòng)、7分為再灌注4～14 min 59 s后出現(xiàn)致死性心室顫動(dòng)、8分為再灌注1～13 min 59 s后出現(xiàn)致死性心室顫動(dòng)、9分為再灌注1 min內(nèi)后出現(xiàn)致死性心室顫動(dòng)。

a.正常竇性心電圖；b.室早二聯(lián)律；c.室速；d.室顫圖1 心電圖

1.3.5冠脈流出液IL-6、IL-10檢測(cè) 于T0、T1取冠脈流出液(從腔靜脈、肺動(dòng)脈斷端流出)放于1.5 ml離心管內(nèi)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)流出液中IL-6、IL-10的濃度，按試劑盒要求進(jìn)行。

1.3.6心肌梗死面積測(cè)算 再灌注結(jié)束后，每組隨機(jī)選取四個(gè)心臟，剪去心房及動(dòng)脈，濾紙吸干。置于-20℃凍存30 min，然后平行于房室溝將心臟切為1 mm的薄片，浸泡于1%TTC溶液中〔pH7.4，由磷酸鹽緩沖液(PBS)配成〕避光保存，37℃恒溫水浴20 min，梗死區(qū)為灰白色，非梗死區(qū)為磚紅色。數(shù)碼相機(jī)拍照，Image J軟件分析心肌梗死面積(IS)。IS=(灰白色區(qū)面積/總面積)×100%。

1.3.7MDA和SOD的檢測(cè) 再灌注結(jié)束后，取每組剩余的4個(gè)離體心臟，剪碎，研磨勻漿，經(jīng)3 000 r/min 4℃離心15 min后取上清液，遵照試劑盒步驟處理后通過紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定SOD活性及MDA含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析、Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。

2 結(jié) 果

2.1各組血流動(dòng)力學(xué)的比較 與T0時(shí)比較，IR組、O3P組T1時(shí)HR明顯減慢，LVDP明顯降低(P<0.05)。T1時(shí)，C組HR明顯快于IR組和O3P組(P<0.05)，LVDP明顯高于IR組、O3P組(P<0.05)；O3P組HR明顯快于IR組(P<0.05)，LVDP明顯高于IR組(P<0.05)。見表1。

表1 3組在不同時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

2.2各組RA比較 正常對(duì)照組灌注過程中除偶發(fā)室性早博(<49次)外未見其他RA，故不進(jìn)行RA評(píng)分。與IR組相比，O3P組室顫時(shí)程縮短，室速發(fā)生率和室顫發(fā)生率減少，RA評(píng)分降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組家兔再灌注心律失常比較(n=8)

2.3各組炎癥因子比較 與T0時(shí)比較，IR組和O3P組T1時(shí)IL-6、IL-10濃度均明顯升高(P<0.05)。T1時(shí)，C組IL-6、IL-10濃度明顯低于IR組和O3P組(P<0.05)；O3P組IL-6濃度明顯低于IR組(P<0.05)，IL-10濃度明顯高于IR組(P<0.05)。見表3。

表3 3組在不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子比較

2.4各組MDA和SOD比較 與C組相比，IR組和O3P組MDA濃度明顯增高，SOD濃度明顯降低(均P<0.05)；與IR組相比，O3P組MDA濃度明顯降低，SOD濃度明顯增高(均P<0.05)。見表4。

表4 各組MDA、SOD濃度比較

2.5各組心肌梗死面積比較 C組心肌梗死面積百分比為(0.0±0.0)%、IR組為(16.2±5.0)%、O3P組為(8.0±1.0)%。與C組相比，IR組和O3P組心肌梗死面積均明顯增加(P<0.05)。與IR組相比，O3P組心肌梗死面積明顯減小(P<0.05)。

3 討 論

心肌缺血后再灌注會(huì)引起RA，常表現(xiàn)為室性心律失常〔1〕。隨著生活水平的提高，人口老齡化的進(jìn)展及心臟外科技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)行體外循環(huán)下冠脈搭橋術(shù)的老年患者越來(lái)越多，而術(shù)后由于再灌注損傷導(dǎo)致的患者心律失常，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后〔7〕。目前研究認(rèn)為交感神經(jīng)過度激活和炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注誘發(fā)室性心律失常的兩個(gè)主要因素〔8，9〕。O3是氧氣的同素異形體，在常溫下，它是一種有特殊臭味的淡藍(lán)色氣體。O3氧化能力極強(qiáng)，其氧化還原電位僅次于氟，比氧氣更易溶于水。現(xiàn)有的研究提示O3可以通過減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)缺血再灌注臟器的保護(hù)作用〔10〕。

心肌缺血后再灌注會(huì)引起心臟收縮功能降低〔11〕，LVDP、HR是衡量心臟收縮功能的重要指標(biāo)。本研究表明心臟發(fā)生了再灌注損傷，提示兔離體心肌缺血-再灌注模型制備成功。本研究表明O3預(yù)處理改善了心臟收縮功能。心肌缺血再灌注后存活心肌的多少對(duì)心臟功能的恢復(fù)具有重要意義，普遍認(rèn)為TTC染色檢測(cè)存活心肌結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為識(shí)別梗死心肌和存活心肌的標(biāo)準(zhǔn)方法〔12〕。本研究表明O3預(yù)處理減輕了兔離體MIRI，進(jìn)一步顯示出O3預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。

RA是MIRI后的特征性表現(xiàn)。嚴(yán)重的再灌注心律失常如室速或室顫，可影響心臟的灌注，進(jìn)一步加重MIRI。本研究結(jié)果表明O3預(yù)處理能減少再灌注期間室速的發(fā)生率，減少室顫的發(fā)生率和發(fā)作時(shí)程，降低RA評(píng)分，提示O3預(yù)處理對(duì)可以改善RA發(fā)生及發(fā)作。

炎癥反應(yīng)在RA中發(fā)揮著重要作用〔9〕，心臟缺血后再灌注使血管內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6等細(xì)胞因子、黏附因子，并釋放如血小板刺激因子等炎性介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)使得血管通透性增加，引發(fā)水腫，并損傷心肌細(xì)胞，使得細(xì)胞膜通透性增加，造成鈣超載，引起心律失常〔2〕。IL-10是機(jī)體內(nèi)重要的抗炎因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可以抑制炎癥因子的合成與釋放，具有減輕炎癥反應(yīng)的作用，研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注時(shí)IL-10通過抑制TNF-α RNA的表達(dá)和細(xì)胞間黏附分子的激活，來(lái)下調(diào)炎癥反應(yīng)，從而減輕MIRI〔13,14〕。現(xiàn)有研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)在心肌缺血-再灌注過程中參與RA形成，減輕外周和中樞炎癥反應(yīng)可能是降低RA發(fā)生率的一種治療方法。O3可以與多不飽和脂肪酸等抗氧化劑及各種過氧化物發(fā)生反應(yīng)從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)〔3〕，但O3預(yù)處理是否可以改善RA發(fā)生尚不清楚。本研究結(jié)果表明缺血后再灌注會(huì)導(dǎo)致心肌損傷。本研究還提示O3預(yù)處理可以抑制炎癥因子的釋放并且促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)MIRI的保護(hù)作用，降低RA發(fā)生。

氧化應(yīng)激反應(yīng)在RA中也發(fā)揮著重要的作用，缺血-再灌注期間，氧自由基生成增多但清除減少，破壞心肌細(xì)胞膜完整性，使其通透性增加，影響細(xì)胞膜上Na+-K+泵的功能，心肌細(xì)胞的應(yīng)激性和自律性增高，易于形成折返，發(fā)生RA。體內(nèi)氧自由基過剩是導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的根本原因，正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)的氧自由基可以被SOD等抗氧酶清除，機(jī)體處在一種氧化還原平衡狀態(tài)。但是當(dāng)心臟發(fā)生缺血-再灌注后，氧化平衡被打破，過剩的氧自由基會(huì)攻擊細(xì)胞膜，產(chǎn)生MDA等產(chǎn)物，因此SOD活性和MDA含量可直接和間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度〔15〕。已有研究發(fā)現(xiàn)適量的O3預(yù)處理可以增加機(jī)體抗氧化能力，從而發(fā)揮對(duì)MIRI的保護(hù)作用〔16〕，但是關(guān)于其能否減少RA發(fā)生尚未有研究。本研究發(fā)現(xiàn)O3預(yù)處理可以減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，增加SOD的活性，減輕心臟的氧化應(yīng)激損傷，從而改善RA發(fā)生。

本研究的不足之處在于選擇離體心臟模型，未涉及整體神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)的研究，并且未對(duì)O3預(yù)處理降低RA發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行深入研究，未對(duì)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的上下游關(guān)鍵調(diào)控因子進(jìn)行研究，下一步將進(jìn)一步研究其保護(hù)作用的具體機(jī)制。

綜上，O3預(yù)處理能夠改善老年兔缺血-再灌注后心肌的收縮力，顯著減少RA發(fā)生，其作用可能與減輕了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激造成的心肌損傷有關(guān)。