蕎麥七水提物通過調控LncRNA SOX21-AS1/miR-451a通路抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的機制

李治國 王花花 袁媛 柳淼 常歡

(焦作市人民醫院消化科，河南 焦作 454000)

胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤，也是導致癌癥相關死亡的第三大原因，2018年約有100萬新發病例，有78.3萬死亡病例，男性的發病率是女性的2倍〔1〕。盡管近年來包括手術、化療、放療和靶向治療在內的多模式治療有所改善，但晚期胃癌患者的預后仍面臨著挑戰。因此，迫切需要闡明胃癌潛在的調控網絡，探尋新的治療策略，提高患者的生活質量。蕎麥七為蓼科植物翼蓼Pteroxygonum giraldii Damme et diels的干燥塊根，屬秦嶺“七藥”之一，具涼血止血、除濕解毒之功，用于痢疾、崩漏、疔瘡、狂犬咬傷等的治療〔2〕。研究表明，蕎麥七水提物對肺癌、乳腺癌細胞的增殖具有抑制作用〔3,4〕。然而蕎麥七水提物對胃癌細胞的毒性作用及其機制尚未可知。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的轉錄物，在多種癌癥中異常表達〔5〕。LncRNA SOX21反義RNA1(SOX21-AS1)在肝細胞癌組織和細胞中高表達，干擾其表達可抑制肝癌細胞的增殖和轉移，誘導細胞凋亡〔6〕。SOX21-AS1在宮頸癌中高表達，敲低其表達抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的內源性非編碼RNA，涉及許多病理和生理過程，包括癌癥〔8〕。miR-451a在骨肉瘤中低表達，抑制骨肉瘤細胞的生長和侵襲〔9〕。miR-451a在肝癌組織中顯著低表達，過表達miR-451a抑制肝癌細胞的增殖〔10〕。但LncRNA SOX21-AS1對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及LncRNA SOX21-AS1與miR-451a的靶向關系罕見研究報道。本研究探討蕎麥七水提物在胃癌MKN45細胞增殖、遷移、侵襲中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 胃癌細胞株MKN45購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，蕎麥七購自焦作康華藥業，RPMI1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司，TRIzol、Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，噻唑藍(MTT)購自Sigma-Aldrich公司，RIPA裂解液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Pierce公司，細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋公司，基質膠購自美國BD公司，si-NC、si-SOX21-AS1、miR-NC、miR-451a、pcDNA-SOX21-AS1、pcDNA、pcDNA-SOX21-AS1購自上海GenePharma公司。

1.2蕎麥七水提物制備 蕎麥七水提物的制備參照李健等〔3〕的方法進行，即稱取50.0 g蕎麥七藥材粉末，以料液比1∶10的比例加入去離子水，在50℃條件下超聲提取40 min，提取2次，合并2次濾液，濃縮、干燥。

1.3臨床標本 選取20例2015年5月至2018年10月于焦作市人民醫院接受手術治療的胃癌患者的癌組織及癌旁組織(癌旁組織為距離胃癌組織≥3 cm的正常組織，病理檢查未發現癌細胞)為研究對象。其中男14例，女6例，年齡23～75歲，平均年齡51歲。所有患者術前未接受過放化療，研究前獲得每名患者或其家屬的知情同意書。標本切除后立即放入液氮中保存。

1.4細胞培養與處理 MKN45細胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。細胞生長至80%匯合時，胰酶消化，按照1∶3的比例接種傳代。選取對數生長期的MKN45細胞，制成1×105個/ml的濃度，于37℃、5% CO2培養箱培養24 h，分別加入10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml蕎麥七水提物〔3〕，同時將不使用任何處理的細胞設為對照組。

1.5實時熒光定量PCR(qPCR)檢測LncRNA SOX21-AS1和miR-451a表達 胃癌組織和MKN45細胞中總RNA的提取使用TRIzol試劑進行，逆轉錄成cDNA。采用cDNA作為模板，檢測LncRNA SOX21-AS1和miR-451a表達。SOX21-AS1正向引物序列為5′-GGCTCAGGTTTAGGCGAGTG-3′，反向引物序列為5′-AGAGGCTCTCCTACTCGTGC-3′；miR-451a正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACT-3′，反向引物序列為5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′。U6作為內參，LncRNA SOX21-AS1和miR-451a水平由2-ΔΔCt方法計算。

1.6MTT檢測細胞增殖 將MKN45細胞調整為1×104個/ml，接種于96孔板，培養48 h，將20 μl MTT溶液添加至每孔細胞，孵育4 h，之后添加150 μl二甲基亞砜，室溫下震蕩培養10 min，用酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值，根據公式計算MKN45細胞生長的抑制率。抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.7Western印跡檢測目的蛋白表達 MKN45細胞使用RIPA裂解液在冰上提取5 min，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對蛋白樣品進行分離，轉至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂牛奶封閉后，膜與CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14、GAPDH一抗孵育過夜，次日，用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(TBST)沖洗膜，與二抗孵育1 h，TBST沖洗膜，增強化學發光液顯色、顯影。

1.8Transwell小室法檢測MKN45細胞遷移、侵襲 為了檢測細胞侵襲，Transwell上室預先涂上與無血清RPMI1640培養基充分混合的基質膠。MKN45細胞用無血清培養基稀釋成5×104個/ml的密度，接種200 μl于上室。同時，將600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養基加入下室。培養24 h后，用棉簽擦拭多余細胞，用甲醛固定，結晶紫染色。置顯微鏡下觀察并記錄侵襲細胞數。在細胞遷移過程中，上室不使用基質膠包被，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.9細胞轉染 將5×105個/ml的MKN45細胞接種于6孔板。細胞生長至70%匯合時，按照Lipofectamine 2000試劑說明書的指示，分別在MKN45細胞中轉染si-NC、si-SOX21-AS1、miR-NC、miR-451a、pcDNA-SOX21-AS1、pcDNA、pcDNA-SOX21-AS1，其中，轉染pcDNA和pcDNA-SOX21-AS的細胞加入蕎麥七水提物(40 mg/ml)進行處理。轉染48 h后，收集細胞，進行細胞增殖、遷移、侵襲等的檢測。

1.10生物信息學預測與雙熒光素酶報告實驗 starBase工具(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測發現，LncRNA SOX21-AS1與miR-451a具有部分結合位點。分別構建含有miR-451a結合位點的野生型SOX21-AS1(WT-SOX21-AS1)和突變型SOX21-AS1(MUT-SOX21-AS1)質粒，利用Lipofectamine 2000試劑將其與miR-451a或miR-NC共轉染，48 h后測定熒光素酶相對活性。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1LncRNA SOX21-AS1和miR-451a在胃癌組織中的表達 與癌旁組織比較，胃癌組織中LncRNA SOX21-AS1表達量顯著升高，miR-451a表達量明顯減少(P<0.05)，見表1。

表1 LncRNA SOX21-AS1和miR-451a在胃癌組織中的表達

2.2蕎麥七水提物對胃癌MKN45細胞中LncRNA SOX21-AS1和miR-451a表達的影響 與對照組相比，10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml蕎麥七水提物明顯降低MKN45細胞中LncRNA SOX21-AS1表達量，顯著提高miR-451a表達量，且二者均呈濃度依賴性(P<0.05)。見表2。

2.3蕎麥七水提物對胃癌MKN45細胞增殖的影響 10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml蕎麥七水提物作用的MKN45細胞生長的抑制率明顯高于對照組，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表3。相較于對照組，10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml蕎麥七水提物明顯減少MKN45細胞CyclinD1蛋白表達量，顯著提高p21、p27蛋白水平，并呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 增殖相關蛋白表達

2.4蕎麥七水提物對胃癌MKN45細胞遷移、侵襲的影響 10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml蕎麥七水提物處理的MKN45細胞遷移細胞數、侵襲細胞數明顯低于對照組，并呈濃度依賴性(P<0.05)。同對照組相比，10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml蕎麥七水提物顯著降低MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達量，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表3、圖2、圖3。

圖2 蕎麥七水提物對胃癌MKN45細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

圖3 Western印跡檢測MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達

2.5抑制LncRNA SOX21-AS1表達對胃癌MKN45細胞增殖、遷移、侵襲的影響 在MKN45細胞中轉染si-SOX21-AS1，LncRNA SOX21-AS1表達量明顯低于si-NC組(P<0.05)。與si-NC組比較，抑制LncRNA SOX21-AS1表達明顯增加MKN45細胞增殖抑制率、p21蛋白表達量，顯著減少遷移細胞數、侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達量(P<0.05)。見圖4、表4、圖5。

圖4 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

圖5 胃癌MKN45細胞的遷移侵襲(結晶紫染色，×200)

2.6LncRNA SOX21-AS1靶向調控miR-451a的表達 starBase網站預測發現，SOX21-AS1的序列中含有與miR-451a互補的核苷酸序列(圖6)。雙熒光素酶報告實驗數據表明，與miR-NC組相比，miR-451a明顯抑制WT-SOX21-AS1熒光素酶活性(P<0.05)，對MUT-SOX21-AS1熒光素酶活性無顯著影響(表5)。si-SOX21-AS1組較si-NC組明顯提高miR-451a表達量(2.34±0.23 vs 1.00±0.09，P<0.05)，pcDNA-SOX21-AS1組較pcDNA組顯著降低miR-451a表達量(0.39±0.04 vs 1.01±0.08，P<0.05)。

圖6 SOX21-AS1的序列中含有與miR-451a互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.7LncRNA SOX21-AS1過表達逆轉了蕎麥七水提物(40 mg/ml)對胃癌MKN45細胞增殖、遷移、侵襲的作用 與對照組比較，蕎麥七水提物(40 mg/ml)明顯影響MKN45細胞中SOX21-AS1、miR-451a、抑制率、遷移細胞數、侵襲細胞數、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05)。同蕎麥七水提物+pcDNA組相比，蕎麥七水提物+pcDNA-SOX21-AS組明顯提高MKN45細胞中SOX21-AS1表達量、遷移細胞數、侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05)，顯著降低miR-451a表達量、抑制率、p21蛋白表達(P<0.05)。見圖7、圖8、表6。

1～4：對照組,蕎麥七水提物組，蕎麥七水提物+pcDNA組，蕎麥七水提物+pcDNA-SOX21-AS1組圖7 Western印跡檢測CyclinD1、P21、MMP-2、MMP-9蛋白表達

圖8 LncRNA SOX21-AS1過表達逆轉了蕎麥七水提物對胃癌MKN45細胞遷移、侵襲的作用(結晶紫染色，×200)

3 討 論

胃癌的發展是一個多步致癌過程，涉及大量的遺傳和表觀遺傳改變。盡管在外科手術和分子靶向治療方面取得了快速進展，但胃癌患者的臨床結果仍不樂觀。根據報道，2013年我國胃癌患者死亡病例達約30.1萬例〔11〕。可能是由于腫瘤細胞的快速增殖、遷移、侵襲和耐藥，導致胃癌患者預后不良。現有的胃癌化療藥物缺乏穩健的療效，并伴有許多副作用。因此，目前的研究集中在預防和治療胃癌及其他惡性腫瘤的更有效且副作用更低的藥物方面。

蕎麥七是我國傳統中藥，始載于《圖經本草》〔2〕，包含黃酮類、酚酸類、三萜類等活性成分。現代藥理研究表明，蕎麥七提取物對枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌等表現出顯著的體外抑制作用〔12〕，還可清除羥基自由基，抑制超氧陰離子自由基〔13〕。除了顯著的抑菌、抗氧化等活性，蕎麥七被發現具有抗癌活性。研究發現，隨著蕎麥七水提物濃度的增加和作用時間的延長，肺癌A549細胞的存活率逐漸減低，顯示出一定的抗腫瘤作用〔3〕。不同濃度的蕎麥七提取物可以抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖及細胞中MMP-9、C-myc蛋白表達，影響細胞的浸潤轉移〔4〕。而關于蕎麥七對胃癌的影響尚未見諸報道。本研究發現蕎麥七水提物以濃度依賴方式明顯抑制胃癌MKN45細胞增殖、遷移和侵襲，減少CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達而顯著提高p21、p27蛋白水平，為蕎麥七的抗腫瘤作用提供了新的證據。

LncRNA影響細胞增殖、細胞分化和凋亡等許多細胞和發育過程〔14〕。現階段，失調LncRNA在腫瘤中的功能越來越受到關注。LncRNA可能通過作為腫瘤抑制因子或致癌基因，在癌癥的發生發展過程中發揮復雜而廣泛的調控作用，包括胃癌〔15，16〕。研究報道了SOX21-AS1在幾種腫瘤中的生物學功能，例如，SOX21-AS1在肺腺癌中高表達，敲低其表達可顯著抑制肺腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡〔17〕。SOX21-AS1在結直腸癌組織和細胞中高表達，沉默其表達可抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲〔18〕。這些研究揭示SOX21-AS1可作為腫瘤促進劑。然而，SOX21-AS1在胃癌中的表達及其作用鮮見報道。本實驗中，SOX21-AS1在胃癌組織中表達上調，抑制其表達明顯抑制胃癌MKN45細胞的增殖、遷移和侵襲，這與前述結論一致，SOX21-AS1在胃癌進展中起致癌作用。另外，蕎麥七水提物以濃度依賴方式降低MKN45細胞中SOX21-AS1表達，推測蕎麥七水提物的抗胃癌作用與下調SOX21-AS1表達有關。

本實驗發現，miR-451a在胃癌組織中表達下調，這與其他癌癥〔9,10,〕中的表達情況相同。Shen等〔19〕報道指出，miR-451a通過靶向活化轉錄因子(ATF)2抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲。Xu等〔20〕發現，miR-451a通過調控結直腸癌中B細胞受體相關蛋白(BAP)31，誘導內質網應激，從而抑制細胞增殖和誘導凋亡。這些研究說明miR-451a在癌癥中扮演著抑癌基因的角色。本項研究中，蕎麥七水提物以濃度依賴方式提高胃癌MKN45細胞中miR-451a表達，推測miR-451a同樣參與蕎麥七水提物的抗癌作用，蕎麥七水提物可能通過抑制SOX21-AS1，促進miR-451a表達來調控胃癌細胞增殖、遷移侵襲。