敲低BCLAF1對肝癌SMMC-7221細胞增殖、侵襲及耐藥性的影響

朱朝玉，范長儒，張玉良

(臨沂市腫瘤醫院普通外科二病區，山東 臨沂 276034)

在全球范圍內，肝癌的發病率在所有癌癥中排名第六位，在癌癥相關死亡中排名第二位[1]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發性肝惡性腫瘤的75%～90%，是肝癌相關死亡的主要原因[2]。早期HCC的癥狀通常不明顯，當癥狀出現時，大多數HCC已經發展至晚期。HCC外科治療選擇主要是肝移植和手術切除，然而，有相當數量的中晚期患者已不適合手術治療，導致預后很差[3]。因此，探尋可用于HCC治療的新靶標尤為重要。Bcl-2相關轉錄因子1(bcl-2-associated transcription factor 1，BCLAF1)最初發現是作為一種能與Bcl-2家族發生作用的蛋白質。多年來，據報道BCLAF1參與多種生物過程，包括T細胞活化、肺發育、溶菌感染程序的控制、DNA損傷和修復[4-5]，甚至轉錄后事件，例如mRNA的剪接加工[6]。此外，BCLAF1基因的突變或異常表達也與人類癌癥密切相關。盡管大多數研究表明BCLAF1通過抑制Bcl-2家族的抗凋亡蛋白發揮腫瘤抑制因子作用，但最近的一項研究報道BCLAF1調節結腸癌細胞的腫瘤發生，其敲除能抑制結腸癌細胞增殖，過表達增強致瘤潛力[7]。本研究通過敲低BCLAF1，借以探討其對肝癌SMMC-7221細胞增殖、侵襲及耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌SMMC-7221細胞(目錄號：TCHu52)購買自中國上海中科院細胞庫；RNA提取試劑盒(貨號：ZP401)、反轉錄試劑盒(貨號：ZR102)、qPCR試劑盒(貨號：ZF201)購買自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；引物合成及shRNA-BCLAF1載體構建由自上海吉凱基因技術有限公司完成；轉染試劑Lipofectamine 2000(貨號：11668019)購買自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；RPMI 1640 細胞培養基(貨號：31800022 )、胰蛋白酶(貨號：25200056)購買自美國 Gibco 公司；胎牛血清(貨號：04-001-1ACS)購買自以色列 BI 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：20201ES76)購買自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗人BCLAF1(貨號：26809-1-AP)、PI3K(貨號：67071-1-Ig)、p-PI3K(貨號：60225-1-Ig)、Akt(貨號：60203-2-Ig)、p-Akt(貨號：66444-1-Ig)、β-actin(貨號：66009-1-Ig)單抗，辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗兔IgG二抗(貨號：10285-1-AP)購買自美國Proteintech Group公司；MTT檢測試劑盒(貨號：ZY2050-500T)購買自上海澤葉生物技術公司；Transwell小室(貨號：3421)購買自美國Corning公司；索拉非尼(貨號：Y0002098)購買自美國sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與脂質體轉染 取出凍存的SMMC-7221細胞，置于37 ℃水浴條件下融化，凍存液部分溶解時取出，在無菌操作臺下吸取凍存液加入完全培養基混勻后離心去上清液，加入適量添加有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基重懸細胞，于37 ℃、5%CO2濃度條件下恒溫培養。觀察培養細胞生長到合適狀態后，按照空白對照組、shRNA-NC(陰性對照)組、shRNA-BCLAF1組分別進行轉染，在聚苯乙稀管中制備A液：0.8 μg DNA(空白對照組無DNA；shRNA-NC組為shRNA-NC載體：F∶5′-GAAACACAGACGGAGGGAA-3′,R∶5′-TTCCCTCCGTCTGTGTTTC-3′； shRNA-BCLAF1組為shRNA-BCLAF1載體：F∶5′-GAAGGACAGACGCAAGGAA-3′，R∶5′-TTCCTTGCGTCTGTCCTTC-3′，靶向BCLAF1基因編碼序列2733-2751bp)稀釋于50 μL無血清無抗生素的培養液中，B液：2 μL Lipofectamine 2 000稀釋于50 μL無血清無抗生素的培養液中，輕輕混合A、B液，室溫中置10～15 min；吸去SMMC-7221細胞培養孔的培養基，用無血清培養基清洗細胞兩次；將混合后的A、B液加入培養孔，前后搖動培養板使其分布均勻；將細胞放入培養箱孵育4～6 h后，可以更換含血清培養基，培養24～48 h后可以觀察轉入基因表達情況。

1.2.2 qPCR鑒定干擾效果 按照RNA提取試劑盒說明書提取各組SMMC-7221細胞RNA，使用反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA，按照qPCR試劑盒說明書配置反應體系進行qPCR，采用2-ΔΔCt法以β-actin作為內參計算BCLAF1 mRNA的相對表達量。BCLAF1：F∶5′-AAGGTCTGGGTCTGGTrCTG-3′，R∶5′-GAGCATTCTGTGGTGCGATT-3′，擴增片段大小122bp；β-actin：F∶5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，R∶5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA-3′，擴增片段大小185 bp。每組SMMC-7221細胞重復3次。

1.2.3 Western blot 鑒定干擾效果 提取各組SMMC-7221細胞蛋白，使用PBS沖洗細胞，加入0.25%胰蛋白酶進行消化處理3～5 min，用完全培養基終止消化反應，重懸細胞后用PBS清洗兩次，離心棄上清。加入50 μL細胞裂解液，冰浴條件下超聲粉碎細胞10 s，重復3次，離心收集上清液。按照BCA法使用試劑盒測定蛋白質濃度；根據測量濃度加入相應體積的待測樣品于SDS-PAGE凝膠中，以25 mA恒定電流電泳1～2 h ；將凝膠轉印到PVDF膜上，浸入封閉液中2 h，用TBST清洗膜3次，3 min/次；加入適當比例稀釋的BCLAF1蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗膜3次；加入對應濃度二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗膜3次；避光加入ECL發光染色，使用凝膠成像儀進行成像分析。采用TotalLab2.0 進行灰度分析，以β-actin作為內參，計算蛋白的相對表達量，其相對表達水平用目的蛋白條帶灰度與內參蛋白條帶灰度的比率表示。每組SMMC-7221細胞重復3次。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數生長期且生長狀態良好的上述各組SMMC-7221細胞進行傳代培養，計數后以5×103個細胞每孔接種100 μL于96孔板，培養48 h后取出培養細胞，每孔加入20 μL MTT溶液培養4 h，去除培養基加入150 μL DMSO溶液，搖床震蕩10 min，置于酶標儀(美國Molecular Devices，SpectraMax iD)在570 nm波長下測量各孔吸光度值，增殖率=各組吸光度值/空白對照組吸光度值。每組SMMC-7221細胞重復3次。

1.2.5 Transwell檢測細胞侵襲能力 分別將各組SMMC-7221細胞以1×105個細胞每孔接種200 μL于Transwell上腔中，同時加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI 1 640培養基，培養24 h。24 h后，吸取Transwell上腔多余液體，PBS清洗3次。棉棒在上腔內輕輕旋轉以吸去殘留水分，加入結晶紫染料。5 min后，用自來水緩慢緩沖去除染料溶液。顯微鏡下觀察透膜細胞數，隨機取400×顯微鏡視野5個，侵襲率=各組透膜細胞數/空白對照組透膜細胞數×100%。每組SMMC-7221細胞重復3次。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期且生長狀態良好的上述各組SMMC-7221細胞以1×106個細胞每孔接種100 μL于6孔板中，培養至融合率達到95%后，使用無菌槍頭尖端垂直于培養皿表面進行劃痕，PBS沖洗懸浮細胞，更換新鮮培養基。分別于劃痕即刻及劃痕培養48 h后置于顯微鏡下觀察拍照，采用Image J 2.1.4.7對圖片進行分析，根據公式：細胞遷移率=(劃痕即刻劃痕寬度-培養48 h后劃痕寬度)/劃痕即刻劃痕寬度×100% 進行計算。每組SMMC-7221細胞重復3次。

1.2.7 耐藥性檢測實驗 取對數生長期且生長狀態良好的各組SMMC-7221細胞進行傳代培養，計數后以5×103個細胞每孔接種于96孔板，分別加入添加有濃度分別為0、4、8、12、16 μmol/L的索拉非尼的新鮮培養基。培養48 h后，采用MTT法檢測細胞增殖活性，方法同1.2.4，在570 nm波長下測量各孔吸光度值，根據公式：細胞活性(%)=各組各濃度索拉非尼培養條件下吸光度值/各組0 μmol/L的索拉非尼培養條件下吸光度值×100% 計算細胞活性。每組SMMC-7221細胞重復3次。

1.2.8 Western blot 法檢測PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達水平 取1.2.7中16 μmol/L索拉非尼處理各組SMMC-7221細胞，抽提蛋白，按照1.2.3種方法測定各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達水平。每組SMMC-7221細胞重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 shRNA敲除BCLAF1基因表達效果比較

qPCR結果顯示，空白對照組BCLAF1基因相對表達量為(1.061±0.042)與shRNA-NC組(0.982±0.034)比較，差異無統計學意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組BCLAF1基因相對表達量為(0.428±0.038)低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)。Western blot結果顯示，空白對照組BCLAF1蛋白相對表達量(0.978±0.061)與shRNA-NC組(0.991±0.032)比較，差異無統計學意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組BCLAF1蛋白相對表達量(0.346±0.045)低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組SMMC-7221細胞增殖活性比較

MTT法檢測結果顯示，空白對照組SMMC-7221細胞增殖率為(100.0±0.00)%，與shRNA-NC組(98.26±0.71)%比較，差異無統計學意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細胞增殖率為(64.48±1.34)%，低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組SMMC-7221細胞侵襲能力比較

Transwell檢測結果顯示，空白對照組SMMC-7221細胞侵襲率為(100.0±0.00)%，與shRNA-NC組(98.25±2.51)%比較，差異無統計學意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細胞侵襲率為(34.59±2.27)%，低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見圖3。

2.4 各組SMMC-7221細胞遷移能力比較

劃痕實驗結果顯示，空白對照組SMMC-7221細胞遷移率為(84.61±2.12)%與shRNA-NC組(86.22±1.41)%比較，差異無統計學意義(P>0.05)，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細胞遷移率(34.59±1.62)%，低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見圖4。

2.5 各組SMMC-7221細胞耐藥性比較

MTT法檢測結果顯示，空白對照組各濃度索拉非尼處理條件下SMMC-7221細胞活性與shRNA-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組各濃度索拉非尼處理條件下SMMC-7221細胞活性低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見圖5。

2.6 各組索拉非尼處理后PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達情況比較

Western blot結果顯示，各組PI3K、Akt蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；空白對照組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比率與shRNA-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比率低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見圖6。

3 討論

HCC預后持續不良的原因之一是大部分病例診斷已到晚期，缺乏有效的治療方案。盡管對多種化療和靶向治療藥物進行了評估，但對晚期HCC疾病唯一被證實的治療方法是索拉非尼，而且總體生存益處不大。因此，探索HCC發展機制、尋找可能的治療靶點有助于改善HCC預后。

BCLAF1最初被鑒定為腺病毒E1B19K(BCL-2的同系物)的蛋白質伴侶。BCLAF1參與對BCL-2的調控，通過與抗凋亡蛋白(如BCL-2)結合而引起凋亡。然而，其功能仍然令人迷惑，因為在缺乏BCLAF1的小鼠細胞中未觀察到明顯的細胞凋亡缺陷。此外，BCLAF1可通過拮抗fbeclin-1和BCL-2的相互作用誘導自噬[8]。最近發現BCLAF1與幾種人類惡性腫瘤有關。BCLAF1在胰腺導管腺癌、結腸直腸癌和膀胱癌中上調，并促進腫瘤進展[9-10]。BCLAF1在HCC中的臨床意義和功能尚不清楚。Zhou等[11]證明BCLAF1在HCC中經常上調，BCLAF1的上調與Edmondson分級、較低的總生存率和不良預后有關，表明BCLAF1作為癌基因可能參與HCC發展。為明確BCLAF1對HCC的作用，本研究通過觀察敲低BCLAF1后對肝癌SMMC-7221細胞的影響，探討BCLAF1在HCC中的功能。qPCR和Western blot結果顯示，shRNA-BCLAF1組BCLAF1基因、蛋白相對表達量降低(P<0.05)，證明干擾因素明顯抑制BCLAF1表達。MTT法檢測結果表明，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細胞增殖能力低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)；Transwell檢測結果表明，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細胞侵襲能力低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)；劃痕實驗結果表明，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細胞遷移能力低于空白對照組及shRNA-NC組(P<0.05)，與既往研究一致，表明SMMC-7221細胞在敲低BCLAF1基因表達后，增殖、侵襲及遷移能力受到抑制，提示BCLAF1在HCC中能促進細胞增殖、侵襲及遷移。Mou等[12]報道，BCLAF1可與lncNEAT1啟動子直接相互作用并促進lncNEAT1(一種轉錄調節因子，有助于形成易于癌變的轉錄組，促進腫瘤發生和發展)表達，證明BCLAF1通過靶向lncRNA NEAT1促進肝癌細胞增殖和侵襲；Shao等[4]報道BCLAF1可在缺氧條件下結合HIF-1α，維持長期缺氧條件下HIF-1α活性，促進腫瘤進展。惡性腫瘤較強的增殖及侵襲能力是其發展與轉移的關鍵，提示BCLAF1可作為抑制HCC發展與轉移的靶點在HCC治療中起作用。

索拉非尼是一種口服多激酶抑制劑，通過抑制絲氨酸-蘇氨酸激酶BRAF和CRAF、受體酪氨酸激酶、血管內皮生長因子受體(VEGFRs)和血小板源性生長因子受體(PDGFR- β)，表現出促凋亡和抑制血管生成作用進而抑制HCC增殖發展[13]。迄今為止，索拉非尼仍是FDA批準的唯一治療不能切除的晚期HCC的全身藥物。然而，肝癌患者對索拉非尼的獲得性耐藥是一種普遍現象，限制了其臨床應用[14]。Yu等[15]采用Kaplan-Meier生存法分析HCC中BCLAF1與索拉非尼耐藥的相關性，表明高表達水平BCLAF1可能導致HCC患者對索拉非尼耐藥。在本研究中，shRNA-BCLAF1組各濃度索拉非尼處理條件下SMMC-7221細胞活性降低(P<0.05)，提示敲低BCLAF1能增強HCC細胞對索拉非尼的敏感性，BCLAF1能介導HCC對索拉非尼耐藥，與前人研究一致。

PI3K / Akt通路是人體內至關重要的信號轉導途徑之一，參與正常的細胞過程，例如細胞存活、增殖和凋亡以及許多生理過程[16]。然而，這種信號的異常激活已在包括HCC在內的人類癌癥中廣泛報道[17]。此外，許多研究報告稱，PI3K/Akt信號的異常激活在對索拉非尼的耐藥性發展中起關鍵作用，抑制該途徑可提高索拉非尼在多種人類惡性腫瘤中的功效[18]。最近的研究還發現，PI3K/Akt通路抑制劑聯合索拉非尼表現出強大的抗HCC效應，并與抑制PI3K及Akt磷酸化有關[19]。在本研究中，索拉非尼處理后，shRNA-BCLAF1組p-PI3K、p-Akt水平降低(P<0.05)，表明敲低BCLAF1能通過抑制PI3K / Akt通路降低HCC對索拉非尼耐藥性，提示BCLAF1可能通過激活PI3K/Akt通路介導索拉非尼耐藥，可將BCLAF1作為糾正HCC索拉非尼耐藥的靶點進一步研究以為臨床服務。

綜上，敲低BCLAF1能抑制肝癌SMMC-7221細胞增殖、侵襲及遷移能力，并降低對索拉非尼的耐藥性，機制可能與抑制PI3K/Akt通路有關，但BCLAF1在HCC發展中的具體機制有待進一步研究。