膀胱癌患者癌組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)與疾病進(jìn)展及復(fù)發(fā)的關(guān)系

秦建文，張楠，劉小林，陳蘇杭，周和平

(中國科學(xué)院國科醫(yī)療江油醫(yī)院泌尿外科，四川 江油 621701)

膀胱癌屬于泌尿系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤，有調(diào)查[1]顯示，在成人惡性腫瘤中，膀胱癌約占8%左右。研究膀胱癌進(jìn)展與復(fù)發(fā)機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)臨床診治，降低患者復(fù)發(fā)率、改善預(yù)后具有重要意義。纖蛋白3(Fibulin-3)屬于細(xì)胞外基質(zhì)中的糖蛋白，在人體廣泛表達(dá)[2-3]。有研究[4]表明，細(xì)胞外基質(zhì)中Fibulin-3起著構(gòu)架作用，并可作用于下游信號(hào)通路，激活表皮生長因子受體信號(hào)通路。多種實(shí)體瘤患者腫瘤組織Fibulin-3異常表達(dá)，具有腫瘤促進(jìn)作用[5]。SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)可對(duì)腫瘤血管形成產(chǎn)生重要調(diào)控作用，參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展[6]。核受體輔激活因子1(NCOA1)為依賴配體的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，在多種病理組織中呈現(xiàn)高表達(dá)水平，可能參與肥胖、癌癥以及糖尿病病理[7]。本文旨在探究膀胱癌患者癌組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)情況與疾病進(jìn)展及復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月至2017年3月中國科學(xué)院國科醫(yī)療江油醫(yī)院收治的104例膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有手術(shù)適應(yīng)癥，并接受根治性全膀胱切除術(shù)；(2)病理證實(shí)為膀胱癌；(3)臨床資料完整；(4)精神、意識(shí)正常，簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、肝、腎等疾病；(2)其他惡性腫瘤患者；(3)具有傳染病史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 包括性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、腫瘤直徑、TNM分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及隨訪3年疾病復(fù)發(fā)情況。

1.2.2 免疫組化檢測 取自手術(shù)切除的癌組織與相應(yīng)配對(duì)癌旁(與腫瘤間隔>5 cm)正常組織。石蠟包埋切片，利用檸檬酸鹽修復(fù)液進(jìn)行抗原的修復(fù)；以3%過氧化氫連續(xù)孵育10 min，同時(shí)對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行封閉處理；以山羊血清封閉。接著分別放入Fibulin-3單克隆抗體、SENP1單克隆抗體及NCOA1單克隆抗體，均由Abcam 公司提供，置于4 ℃條件下孵育過夜。第2天以山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(經(jīng)辣根過氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記，控制稀釋比等于1∶50)處理，室溫下連續(xù)孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，并以蘇木素復(fù)染，利用二甲苯進(jìn)行透明處理。注意以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，用于陰性對(duì)照。安排兩名病理科醫(yī)師，通過雙盲法獨(dú)立完成閱片過程。結(jié)果評(píng)估：在各切片之中隨機(jī)取五個(gè)觀察視野(400×)，進(jìn)行染色評(píng)估，并在200個(gè)細(xì)胞之中，算出陽性細(xì)胞所占百分比。染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：顯示淡黃色為1分；顯示棕黃色為2分；顯示棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：百分比<10%為1分；10%<百分比≤50%為2分；50%<百分比≤80%為3分；百分比>80%為4分。染色評(píng)分+百分比評(píng)分>3分提示陽性表達(dá)[8]。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 采用10%甲醛固定組織樣本，石蠟包埋之后進(jìn)行HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Logistic回歸模型分析；生存分析采取Kaplan-Meier生存曲線分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌與癌旁組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)比較

膀胱癌組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)陽性率高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 膀胱癌與癌旁組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)比較[n(%)]

2.2 不同臨床特征患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)陽性率比較

不同性別、年齡、BMI、腫瘤直徑患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同TNM分期、病理分級(jí)、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 Logistic單因素與多因素回歸分析

Logistic回歸分析顯示，F(xiàn)ibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)情況與TNM分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表2 不同臨床特征患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)陽性率比較[n(%)]

續(xù)表2

表3 Logistic單因素與多因素回歸分析

2.4 Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)的關(guān)系

隨訪發(fā)現(xiàn)，104例患者共復(fù)發(fā)46例(腎盂腫瘤6例、盆腔復(fù)發(fā)5例、尿道復(fù)發(fā)3例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移32例，其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移包括肺9例、骨10例、肝6例、腹膜后盆腔淋巴結(jié)7例)，中位隨訪時(shí)間29(28～31)個(gè)月。Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)陽性患者3年無進(jìn)展生存率低于表達(dá)陰性患者(χ2=12.793、35.840、12.558，P<0.05)。見表4、圖1-圖3。

表4 復(fù)發(fā)情況[n(%)]

3 討論

Fibulins與參與構(gòu)成人體細(xì)胞外基質(zhì)，當(dāng)前已知包含七個(gè)基因型，F(xiàn)ibulin-3具有調(diào)控細(xì)胞生長與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，同時(shí)在腫瘤發(fā)生及演進(jìn)中起著重要作用[9]。相關(guān)研究[10-11]表明，卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌以及胰腺癌中Fibulin-3具有過表達(dá)表現(xiàn)，且和腫瘤進(jìn)展、患者不良預(yù)后有關(guān)，關(guān)于作用機(jī)制，可能由于Fibulin-3啟動(dòng)子區(qū)處于超甲基化狀態(tài)，造成腫瘤惡化。亦有報(bào)道[12]認(rèn)為，對(duì)于膀胱癌而言，F(xiàn)ibulin-3屬于前侵入因子。本研究中，相較于癌旁正常組織，膀胱癌組織Fibulin-3陽性率升高(P<0.05)且與腫瘤TNM分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤深度緊密相關(guān)(P<0.05)，與上述研究觀點(diǎn)相符。說明Fibulin-3可能參與膀胱癌的發(fā)生及進(jìn)展，考慮可能與Fibulin-3調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、基質(zhì)金屬蛋白酶分泌、血管生成、相關(guān)信號(hào)通路(包括NOTCH、MAPK以及AKT等)有關(guān)[13]。有研究[14]表明，SENP1屬于缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)調(diào)控靶基因，SENP1與HIF-1α通過正反饋?zhàn)饔每稍黾痈伟└杉?xì)胞特性，加快肝癌產(chǎn)生。以往研究以前列腺癌患者為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)病灶組織里面SENP1呈現(xiàn)為高表達(dá)，其參與腫瘤侵襲以及復(fù)發(fā)；通過抑制SENP1表達(dá)，能夠影響 HIF-1α與相應(yīng)信號(hào)通路中下游部位基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2) 與基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)骨重構(gòu)作用，從而起到抑制骨轉(zhuǎn)移效果[15]。本研究中，膀胱癌組織SENP1陽性率高于癌旁正常組織(P<0.05)；Logistic分析發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤浸潤深度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，表明SENP1可能具有促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展作用，原因可能和其調(diào)控 HIF-1α活性及其下游血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有關(guān)。鑒于SENP1、Fibulin-3均能夠調(diào)控血管生成，故考慮兩者在膀胱癌進(jìn)展中可能具有協(xié)同作用。HIF1α可能通過結(jié)合以及激活轉(zhuǎn)錄因子NCOA1的方式，調(diào)控C-X-C趨化因子受體4，從而加快腫瘤轉(zhuǎn)移[16]，推測SENP1與NCOA1共同參與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。有報(bào)道[17]顯示，膀胱癌患者NCOA1蛋白表達(dá)水平和臨床分期、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在顯著相關(guān)性。本研究顯示，膀胱癌組織NCOA1陽性率異常升高(P<0.05)，并和腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)，與上述研究觀點(diǎn)一致，并創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)NCOA1和膀胱癌病理分級(jí)及浸潤等進(jìn)展密切相關(guān)。NCOA1能夠通過提高雄激素受體(AR)活性的方式介導(dǎo)細(xì)胞增殖，對(duì)其進(jìn)行敲除，可以減少雄激素依賴的相應(yīng)細(xì)胞(如LNCap細(xì)胞)增殖，同時(shí)對(duì)AR依賴細(xì)胞(如C4-2細(xì)胞)生長產(chǎn)生抑制作用[18]。

以往關(guān)于不同F(xiàn)ibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)膀胱癌患者生存分析的研究極少。本研究經(jīng)生存分析創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ibulin-3、SENP1、NCOA1表達(dá)陽性患者3年無進(jìn)展生存率明顯更低(P<0.05)，提示Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性膀胱癌患者存在更高疾病進(jìn)展與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，相較于正常組織，膀胱癌組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性率更高，且和疾病進(jìn)展與復(fù)發(fā)緊密相關(guān)，其檢測對(duì)患者疾病診治及預(yù)后評(píng)估具有重要指導(dǎo)價(jià)值。但本研究具有一定局限性，比如樣本量較少，為單中心研究，且僅采用免疫組化分析法，方法有限，關(guān)于Fibulin-3、SENP1與NCOA1參與膀胱癌進(jìn)展與復(fù)發(fā)具體分子機(jī)制，有待后續(xù)大樣本、多檢測方式及多中心研究進(jìn)一步探究、補(bǔ)充與完善。