馬曉慶,劉 洋,孫楊贏,2,*,潘道東,2,曹錦軒,2
(1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 寧波 315800;2.浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315800)
亞硝酸鹽是肉類制品中一種獨(dú)特的添加劑,能夠抑制微生物生長(zhǎng);具有很強(qiáng)的抗氧化性,能夠抑制脂肪氧化;同時(shí)賦予肉制品特征性的腌制肉色和腌肉風(fēng)味[1-2]。但是,亞硝酸鹽會(huì)在特定條件下轉(zhuǎn)變?yōu)镹-亞硝胺[3],當(dāng)人體攝入一定量時(shí)會(huì)有致癌致畸的危險(xiǎn)。為了解決這一問題,替代亞硝酸鹽的天然或合成色素的開發(fā)研究成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者們?nèi)找骊P(guān)注的話題。目前已經(jīng)開發(fā)研究了許多天然或合成的亞硝酸鹽替代品,例如:Li Peijun等[4]研究表明在香腸中加入不含亞硝酸鹽的木糖酵母菌可以達(dá)到與NaNO2相似的a*值,Zhu Yinglian等[5]研究植物乳桿菌部分替代NaNO2能夠降低亞硝酸鹽含量,改善香腸的顏色,但上述研究均未考察菌株的添加是否具有抑制脂質(zhì)氧化的功能;還有研究發(fā)現(xiàn)櫻桃粉[6]或番茄渣-有機(jī)薄荷精油的超臨界流體提取物[7]可以改善香腸的色澤、降低亞硝酸鹽殘留和抑制脂肪氧化,但并未涉及蛋白質(zhì)降解和整體可接受度的研究;此外,國(guó)內(nèi)外對(duì)紅曲色素作為亞硝酸鹽替代物的研究較多,但是紅曲色素對(duì)光照、高溫、酸堿、重金屬敏感,在肉制品加工中易出現(xiàn)變色現(xiàn)象產(chǎn)生質(zhì)量問題[8]。因此,由于現(xiàn)有的亞硝酸鹽替代品制作成本和銷售價(jià)格太高或無(wú)法達(dá)到亞硝酸鹽的全部作用,所以沒有進(jìn)入大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。到目前為止,尚未開發(fā)出能夠發(fā)揮亞硝酸鹽全部作用的單一物質(zhì),亞硝酸鹽在肉制品中仍然是最常用的添加劑[9],但在一定條件下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镹-亞硝胺,具有潛在危害,故在肉品加工過程中需嚴(yán)格控制其添加量。
由亞硝酸鹽和豬血紅蛋白(hemoglobin,Hb)形成的亞硝基血紅蛋白(nitrosohemoglobin,NHb)具有良好的著色能力[10],但NHb發(fā)色穩(wěn)定性不理想[11],所以沒有投入大量生產(chǎn),為了解決NHb穩(wěn)定性不理想的問題,由豬血、亞硝酸鹽和糖通過美拉德反應(yīng)合成的糖基化NHb,在肉類腌制過程中發(fā)揮著色、抗氧化和防腐的作用[10]。Li Meng等[12]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)磷酸化可能通過影響肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性而促進(jìn)肉色的形成。由于肌紅蛋白與Hb的結(jié)構(gòu)和功能具有很大的相似 性[13],所以本研究對(duì)Hb進(jìn)行亞硝基磷酸化處理得到磷酸化亞硝基血紅蛋白(phosphorylated nitrosohemoglobin,P-NHb)以達(dá)到提高穩(wěn)定性的目的,通過前期實(shí)驗(yàn)研究已證明P-NHb具有較強(qiáng)穩(wěn)定性。本研究所用的Hb來(lái)源于新鮮豬血,資源豐富且易得。
乳化腸深受消費(fèi)者喜歡,但在乳化腸中添加亞硝酸鹽存在潛在危害。本研究旨在探討P-NHb對(duì)豬肉乳化腸理化指標(biāo)和感官品質(zhì)的影響,分析貯藏過程中乳化腸的pH值、水分含量、色澤、亞硝酸鹽殘留量、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)值、脂質(zhì)氧化硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值、菌落總數(shù)和感官品質(zhì),以進(jìn)一步研究P-NHb作為一種新型天然色素及其代替亞硝酸鹽的可能性。
新鮮豬血 寧波市北侖食品有限責(zé)任公司;豬肉 市購(gòu);羊腸腸衣 河清腸衣有限公司;食鹽、NaNO2、異抗壞血酸鈉、復(fù)合磷酸鹽、花椒粉、TG酶、谷氨酸鈉、白酒、β-環(huán)糊精均為食品級(jí);氮?dú)狻难帷⑷纫宜帷⒘虼捅韧姿幔ň鶠榉治黾儯?國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;丙酮(色譜純) 杭州高晶精細(xì)化工有限 公司;亞硝酸鹽試劑盒 南京建成生物工程研究所。
H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Infinte 200PRO型酶 標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;FE20 pH計(jì) 德國(guó)Mettler Toledo公司;CR-440色差儀 柯尼卡美能達(dá)辦公系統(tǒng)(中國(guó))有限公司;XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技有限公司;BJRJ-82型絞肉機(jī)、BZBJ-20型斬拌機(jī) 嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司;DN-36W氮吹儀 上海比朗儀器有限公司。
1.3.1 Hb提取純化
于寧波市北侖食品有限責(zé)任公司收集加入0.5%抗凝劑(檸檬酸鈉)的新鮮豬血,全程于4 ℃迅速運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。100 目篩過濾除纖,4 ℃、3 000 r/min離心15 min,收集下層血細(xì)胞[14]。根據(jù)Cho等[15]的方法對(duì)血紅細(xì)胞進(jìn)行處理得到粗Hb。將Hb粗提液通過0.5 μm和0.22 μm濾膜進(jìn)行超濾[16],然后在Hb粗提液加入0.5 mg/100 mL抗氧化劑異抗壞血酸鈉,60 ℃水浴加熱30 min使雜蛋白沉淀,整個(gè)過程通入N2保持真空狀態(tài)防止Hb氧化,3 000 r/min離心15 min,取上清液得到純的Hb[17]。純化后的Hb進(jìn)行冷凍干燥,在-40 ℃條件下保存待用。
1.3.2 NHb和P-NHb的制備和鑒定
參照曹穩(wěn)根等[18]的方法,按照NaNO2添加量為 0.03 g/mL、抗壞血酸添加量為0.02 g/mL制備NHb溶液。根據(jù)前期的研究結(jié)果,磷酸化改性最優(yōu)條件如下,在NHb中添加10 mg/100 mL三聚磷酸鈉,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值到8,在55 ℃水浴鍋中加熱反應(yīng)30 min,室溫冷卻,并將制得的P-NHb溶液透析過夜,整個(gè)過程操作均在黑暗避光條件下進(jìn)行。真空冷凍干燥得到P-NHb粉末, 避光-40 ℃貯存待用。參照夏楊毅等[17]的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,用體積分?jǐn)?shù)80%丙酮溶液溶解,室溫下避光靜置1 h,過濾,在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)濾液吸光度,以80%丙酮溶液為空白對(duì)照。
1.3.3 香腸的制作
參照陳坤朋等[19]的工藝流程和Liu Pengxue等[14]的配方比例稍作修改制備乳化腸,本研究制作5 組不同的乳化腸,其中對(duì)照組(空白)為不添加任何發(fā)色劑;實(shí)驗(yàn)組分為4 組,分別為添加亞硝酸鹽組(NaNO2)、Hb組、NHb組、P-NHb組,其中NaNO2組NaNO2的添加量為0.1 g/kg,其他3 組(不添加NaNO2)的添加量均為1 g/kg。
乳化腸制備工藝流程:瘦肉剔除結(jié)締組織并切丁成3 cm,肥肉切丁,將肥肉與瘦肉混勻后加入鹽、NaNO2/Hb/NHb/P-NHb、β-環(huán)糊精和多聚磷酸鹽混勻腌制,然后在6 mm孔板絞肉機(jī)中絞碎,后使用斬拌機(jī)斬拌腌制好的原料肉,并按順序依次加入白酒、花椒粉、TG酶,斬拌期間不斷加入冰水控制肉糜溫度在10 ℃以下。斬拌完成后將肉糜灌入羊腸腸衣(直徑3 cm)中,75 ℃條件下煮制40 min。煮制結(jié)束放置冷卻后抽真空包裝,于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩T诓煌A存時(shí)間(0、5、10、15、20、25 d和30 d)測(cè)定L*值、a*值、b*值、pH值、菌落總數(shù)、NaNO2殘留量、TVB-N值和TBARS值,并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。
1.3.4 色差測(cè)定
使用色差計(jì)對(duì)樣品色差值進(jìn)行分析,室溫條件下使用D65光源和10°角觀察。色差儀使用前在白板上進(jìn)行校準(zhǔn)。將乳化腸樣品切成15 mm×25 mm的薄片,隨機(jī)選擇腸體4個(gè)不同區(qū)域切片測(cè)定4 次,其結(jié)果用L*(亮度值)、a*(紅度值)和b*(黃度值)表示。
1.3.5 pH值測(cè)定
用pH計(jì)在室溫下(20 ℃)測(cè)定乳化腸pH值。準(zhǔn)確稱取10 g樣品切碎加入90 mL純水中,在搖床中振蕩20 min后測(cè)定pH值。
1.3.6 殘留亞硝酸鹽含量測(cè)定
按照亞硝酸鹽測(cè)定試劑盒中說(shuō)明測(cè)定。將樣品分散在水(70 ℃)中靜置15 min并過濾。根據(jù)濾液與磺基苯胺溶液和顯色劑N-萘基-乙二胺二鹽酸鹽反應(yīng)生成紅色偶氮化合物。在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定上清液吸光度。亞硝酸鹽殘留量按式(1)計(jì)算:

1.3.7 TBARS值測(cè)定
參照施春權(quán)等[20]和GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測(cè)定》[21]的方法稍作修改。TBARS值按式(2) 計(jì)算:

式中:A532nm為樣品在波長(zhǎng)532 nm處的吸光度;m為樣品質(zhì)量/g;9.48為常數(shù)。
1.3.8 TVB-N的測(cè)定
按照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[22]的方法測(cè)定。
1.3.9 菌落總數(shù)
按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[23]。稱取10 g乳化腸,加入90 mL生理鹽水(0.85%),進(jìn)行無(wú)菌拍打。從該樣液中制備連續(xù)10 倍的稀釋液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果以菌落對(duì)數(shù)值(lg(CFU/g)) 表示。培養(yǎng)條件為(36±1)℃、(48±2)h。
1.3.10 感官評(píng)價(jià)
乳化腸的感官評(píng)定按照陳坤朋等[19]的方法并作修改。將蒸煮后的樣品切成約2.5 cm長(zhǎng)度的切片,分給10 位經(jīng)過培訓(xùn)的人員(男女比例為1∶1)進(jìn)行評(píng)分,在每次評(píng)價(jià)之前,小組成員需用純凈水漱口,最大程度降低品嘗疲勞。評(píng)估色澤、氣味、滋味、嫩度、質(zhì)構(gòu)和整體可接受度的基本感官特性。得分制用7 分制(1=非常不喜歡,7=非常喜歡)。
本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 批實(shí)驗(yàn),每批設(shè)置3 次重復(fù),結(jié)果表示為±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 18.0進(jìn)行ANOVA分析,利用Tukey HSD進(jìn)行顯著性分析(P<0.05,差異顯著),采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。
乳化腸的L*值變化如圖1A所示,隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組的L*值基本無(wú)變化(P>0.05),但是P-NHb組樣品的L*值顯著高于NaNO2組、Hb組和NHb組樣品,由圖2可以看出,相比NHb組,添加經(jīng)過磷酸化改性后的顏色鮮亮。黃多[24]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖及其衍生物與NHb進(jìn)行糖基化反應(yīng)制作的新型色素的色澤L*值比對(duì) 照組高,經(jīng)過改性后的Hb亮度值增加,這與本研究結(jié)果一致。肉類產(chǎn)品的粉紅色是檢驗(yàn)其質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[25],由圖1B和圖2可以看出,各組的a*值隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,但添加P-NHb(添加量為1 g/kg)組的a*值顯著高于NaNO2組(添加量為0.1 g/kg)、Hb組(添加量為1 g/kg)和NHb組(添加量為1 g/kg)樣品 (P<0.05),且隨時(shí)間延長(zhǎng),P-NHb組的a*值降低均比其他組少,這表明P-NHb可以改善乳化腸的色澤,同時(shí)能夠維持乳化腸色澤穩(wěn)定,而且不需要與NaNO2復(fù)配使用便可以達(dá)到理想顏色。如圖1C所示,所有組的b*值均顯著增加(P<0.05),這可能是因?yàn)橹|(zhì)氧化產(chǎn)物與磷脂末端基團(tuán)或蛋白質(zhì)中的胺發(fā)生非酶促褐變反應(yīng) 導(dǎo)致[26]。由圖2可知,添加P-NHb的乳化腸比其他組乳化腸的色澤理想,這表明本研究所制得的新型色素P-NHb可以代替NaNO2在肉類制品中發(fā)揮發(fā)色作用。


圖1 貯藏過程中乳化腸的L*(A)、a*(B)、b*(C)值的變化Fig. 1 Changes in L* (A), a* (B) and b* (C) values of emulsified sausage during storage

圖2 不同處理組的乳化腸切片圖Fig. 2 Appearance of emulsified sausage slices in different treatment groups
由圖3可知,各組pH值隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。P-NHb組的pH值下降速度比其他組均小 (P<0.05),Hb組在0~10 d的pH值逐漸增加,這可能與堿性化合物的積累有關(guān),如乳化腸貯藏期間的微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白水解,從而導(dǎo)致氨和其他堿性物質(zhì)的 產(chǎn)生[27],10 d之后開始逐漸下降,而且pH值的下降與水分含量的下降有關(guān)[28],與NaNO2相比,P-NHb增加了貯藏過程中乳化腸的pH值穩(wěn)定性。

圖3 貯藏過程中乳化腸pH值的變化Fig. 3 Changes in pH of emulsified sausage during storage
如圖4所示,在貯存期間NaNO2組顯示出最高亞硝酸鹽殘留水平,但是隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05),下降的原因可能是NaNO2自身氧化以及NaNO2與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和肉中其他成分發(fā)生的氧化還原反應(yīng)[29],Liu Pengxue等[14]研究表明亞硝酸鹽殘留的減少可能是由于還原反應(yīng),亞硝酸鹽氧化以及亞硝酸鹽與蛋白質(zhì),脂質(zhì)和其他肉類成分的結(jié)合所致。其他組均沒有添加NaNO2,亞硝酸鹽含量基本在0.30~6.22 mg/kg(P>0.05)范圍內(nèi),遠(yuǎn)低于GB 2760—2014(<30 mg/kg)。在整個(gè)貯存期間,NaNO2組的亞硝酸鹽含量很高,在特定的高溫或強(qiáng)酸條件下會(huì)導(dǎo)致N-亞硝胺的大量形成,造成不安全因素。P-NHb基本沒有亞硝酸鹽殘留,在肉制品應(yīng)用中相對(duì)安全。

圖4 貯藏過程中乳化腸亞硝酸鹽殘留量的變化Fig. 4 Changes in residual nitrite in emulsified sausage during storage
圖5顯示實(shí)驗(yàn)組的TBARS值均比空白組低。在0~15 d期間P-NHb組比NaNO2組的TBARS值高 (P<0.05),此階段NaNO2對(duì)脂肪氧化的抑制作用明顯優(yōu)于其他組(P<0.05),但從第10天開始NaNO2組的TBARS值直線上升,P-NHb組的上升趨勢(shì)一直平穩(wěn),并無(wú)突增趨勢(shì);當(dāng)貯存15~20 d后,P-NHb組比NaNO2組的TBARS值低(P<0.05),這可能是因?yàn)榱姿峄ㄟ^改變Hb結(jié)構(gòu)影響氧化還原反應(yīng)抑制了脂質(zhì)氧化[30],也可能是抗壞血酸鈉減少了丙二醛的形成[31],Liu Pengxue等[14]研究表明抑制脂質(zhì)氧化的另一可能性是因?yàn)镠b里的血紅素鐵與NO形成了穩(wěn)定的絡(luò)合物。脂質(zhì)氧化對(duì)肉類風(fēng)味的形成有一定影響,適量脂質(zhì)氧化可以賦予肉類令人滿意的風(fēng)味,但是過度氧化會(huì)產(chǎn)生哈喇等不良?xì)馕丁R虼耍|(zhì)氧化在肉制品的風(fēng)味形成和品質(zhì)控制中起到十分重要的作用,從圖5可知,P-NHb在乳化腸中對(duì)脂質(zhì)氧化具有較強(qiáng)的抑制作用,P-NHb比NaNO2具有更強(qiáng)抗氧化性,對(duì)乳化腸長(zhǎng)期貯存時(shí)的品質(zhì)保證更具有優(yōu)勢(shì)。

圖5 貯藏過程中乳化腸TBARS值的變化Fig. 5 Changes in TBARS value of emulsified sausage during storage
Liu Dengcheng等[32]研究發(fā)現(xiàn)香腸樣品在貯藏時(shí)間為14 d時(shí),TVB-N值最高達(dá)到30.7 mg/kg,Jin等[27]發(fā)現(xiàn)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng),TVB-N值逐漸增加,代表肉品腐敗程度越嚴(yán)重。由于TVB-N值在肉與肉制品品質(zhì)變化過程中能有規(guī)律地反映肉品的新鮮程度,因而可以作為肉品質(zhì)量評(píng)定的客觀指標(biāo)。圖6中,所有組分的TVB-N值均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但是實(shí)驗(yàn)組均未超GB 5009.228—2016(35 mg/kg)。Hb組和NHb組的TVB-N值均顯著高于空白組(P<0.05),因?yàn)镠b為蛋白質(zhì),所以會(huì)自身分解增加TVB-N值。P-NHb可能是因?yàn)榱姿峄淖兞薍b結(jié)構(gòu)[33],減少了在加入肉制品時(shí)蛋白質(zhì)分解從而降低了TVB-N值。P-NHb組與NaNO2組的TVB-N值基本持平 (P>0.05),均顯著低于空白組(P<0.05),表明2 組均可有效減少蛋白質(zhì)分解。根據(jù)這一結(jié)果可以得出新型色素P-NHb具有在乳化腸中抑制蛋白質(zhì)分解的作用。

圖6 貯藏過程中乳化腸TVB-N值的變化Fig. 6 Changes in TVB-N value of emulsified sausage during storage
結(jié)合TBARS值結(jié)果得知,P-NHb抑制脂肪氧化和抑制蛋白降解作用比NaNO2強(qiáng),P-NHb具有較強(qiáng)的抗氧化性,在乳化腸貯存期間可以保證乳化腸品質(zhì),延長(zhǎng)乳化腸的貯存時(shí)間,所以P-NHb可以替代NaNO2的抗氧化作用在肉制品中應(yīng)用,且效果更具優(yōu)勢(shì)。
由圖7可知,菌落總數(shù)在0~20 d持續(xù)增加,在20~25 d達(dá)到最大,之后開始下降。實(shí)驗(yàn)組的菌落總數(shù)均比空白組小,而且NaNO2組和P-NHb組均顯著低于空白組、Hb組和NHb組(P<0.05),在整個(gè)時(shí)間段P-NHb組的菌落總數(shù)與NaNO2組均無(wú)顯著差異(P>0.05),可能是因?yàn)橥ㄟ^調(diào)節(jié)糖酵解和其他氧化還原反應(yīng)[31,33]改變了乳化腸的環(huán)境,從而抑制了微生物的大量繁殖,還有部分抑菌作用歸因于制備P-NHb時(shí)殘留的NaNO2[14]。開始階段菌落總數(shù)持續(xù)升高是因?yàn)榍捌谌榛c的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,微生物迅速生長(zhǎng)繁殖。隨時(shí)間延長(zhǎng),乳化腸內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量逐漸降低,限制大部分微生物的生長(zhǎng)繁殖。經(jīng)過25 d的貯藏后,空白組的細(xì)菌總數(shù)已經(jīng)超過GB 4789.2—2016規(guī)定的肉制品細(xì)菌總數(shù)(<4.7(lg(CFU/g)),而實(shí)驗(yàn)組P-NHb組、NaNO2組和Hb組均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。因此,P-NHb具有良好的抑菌作用。
如圖8所示,NaNO2組與P-NHb組色澤無(wú)顯著差異(P>0.05),且P-NHb可以賦予乳化腸理想色澤,得到較高評(píng)分。而空白組的色澤得分最低,這一結(jié)果與Liu Pengxue等[14]的研究結(jié)果一致。在氣味和質(zhì)構(gòu)方面,各組均無(wú)顯著差異(P>0.05);P-NHb組和NHb組的嫩度評(píng)價(jià)則顯著高于其他各組(P<0.05),乳化腸的口感和嫩度與水分含量有關(guān),P-NHb組可能因?yàn)榱姿峄幚砀淖兞薍b的結(jié)構(gòu)從而增加了蛋白質(zhì)的保水性,從而保持了乳化腸的口感和嫩度;而NaNO2組的滋味顯著優(yōu)于P-NHb組(P<0.05),且NaNO2組得分最高;整體可接受度方面,P-NHb組和NaNO2組效果比其他組好,且兩者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。
本實(shí)驗(yàn)研究P-NHb替代NaNO2對(duì)乳化腸理化特性及感官品質(zhì)的影響,結(jié)果表明P-NHb作為一種新型色素,可以考慮其代替NaNO2在肉制品中的應(yīng)用。P-NHb組的亞硝酸鹽殘留量水平較低;P-NHb對(duì)脂肪氧化有良好的抑制作用表明P-NHb具有較高抗氧化性;P-NHb可以賦予肉制品理想的色澤;P-NHb和NaNO2對(duì)乳化腸的TVB-N值無(wú)顯著差別;P-NHb在抑制乳化腸的菌落總數(shù)生長(zhǎng)和NaNO2相似;P-NHb可以維持pH值穩(wěn)定;P-NHb組的整體可接受度和NaNO2組沒有顯著差異。綜上所述,P-NHb可以達(dá)到與NaNO2相似的作用,可以作為一種亞硝酸鹽的潛在替代品。