磺酰脲類除草劑分子印跡聚合物制備及其應用

馮格格，王猛強，李 壯，佘永新，王 淼，曹 振，王珊珊，鄭鷺飛，金茂俊，王 靜，邵 華，金 芬

（中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

磺酰脲類農藥作為一種常用的田間除草劑可以有效防除頑固雜草，該類除草劑分子結構由芳香基、磺酰脲橋和雜環3 部分組成，通過利用不同植物代謝能力、代謝途徑和降解水平的差異實現對雜草的選擇，其被植物的根、葉吸收后，在植物的韌皮部和木質部傳導，通過抑制乙酰乳酸合成酶的生成抑制植物細胞的分裂增長，從而達到除草的目的[1]。因其用量小、活性高、對哺乳動物毒性較低的特點，磺酰脲類除草劑已被廣泛應用于水稻、小麥、大麥、大豆、油菜等農作物的田間除草[2]，但由于磺酰脲類除草劑大多屬于長殘效除草劑，其殘留極易對敏感作物造成毒害，甚至影響下茬作物的生長[3]。此外，因磺酰脲類除草劑作用位點單一，在特定地塊的連續施用會使雜草產生抗藥性，由此引發藥物濫用的惡性循環將會對生態環境帶來重大的安全風險。人們食用了超出殘留限量的植物源性食品后，對健康產生風險，甚至引起急性中毒。

目前針對磺酰脲類除草劑的殘留檢測日益成為食品安全領域的研究重點。各國家先后制定了多種磺酰脲類除草劑的最高殘留限量。美國規定苯磺隆和噻吩磺隆在玉米和高粱的草料、谷粒、秸稈及豆科作物種子中的最高殘留限量為0.05 mg/kg。GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》中規定噻吩磺隆、單嘧磺隆、環丙嘧磺隆、甲磺隆、氯磺隆等在部分農產品中的最大殘留限量[4]。農業部第2032號公告還對氯磺隆等7種農藥采取限用管理措施，逐步限售、禁用部分危害性較高的磺酰脲類除草劑，并先后制定了多種磺酰脲類農藥的殘留檢測方法。目前的分析方法主要包括：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術[5]、高效液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用技術[6]、氣相色譜-質譜聯用技術[7]、毛細血管電泳色譜法[8]、生物測定法[9-10]、酶聯免疫分析技術[11-12]等。由于檢測設備在靈敏度上存在局限性，加之復雜基質對殘留檢測結果極易受到干擾、弱化，現有的檢測方法很難對種類較多的磺酰脲類除草劑進行準確、快速的痕量分析[13-14]，其中樣品前處理技術是解決當前檢測技術精準度不高的主要途徑。

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是一種具有較強分子識別能力的新型高分子仿生材料，分子印跡技術基本原理如下[15]：模板分子與功能單體依靠相互作用力（如氫鍵、共價鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用以及空間位阻效應等），在合適的分散介質中形成可逆結合的復合物，當交聯劑存在時，經光、熱、電場及引發劑引發，形成具有一定剛性和柔性的具有立體孔穴的高分子聚合物。之后除去模板分子，得到在空間和結合位點上與模板分子完全匹配的聚合物，即MIPs。MIPs不僅專一性高、制備簡單，而且與天然的分子識別體系（如抗原和抗體、酶和底物）相比，具有高度穩定性和更長的使用壽命[16-19]。以其作為固相萃取柱填料制備的分子印跡固相萃?。╩olecularly imprinted solid-phase extraction，MI-SPE）柱，與傳統的固相萃取柱相比，它克服了樣品基質復雜、富集效果差以及無再生性等不利因素，有效提高了分析準確性和靈敏度，更適用于痕量分析[20-21]。

課題組以甲磺隆為模板分子，利用沉淀聚合法合成磺酰脲類MIPs，并將其與制備的金屬有機框架（metal organic frameworks，MOFs）材料摻雜混合作為復合填料制成MI-SPE柱，結合HPLC-MS，發展了大米樣品10種磺酰脲快速檢測方法[22]；Bastide等[23]制備了對甲磺隆等6種磺酰脲類除草劑都具有較好結合能力的MIPs；Liu Xiangjun等[24]合成了具有規則外形的甲磺隆MIPs球，可從甲磺隆、苯磺隆、芐嘧磺隆和噻吩磺隆中較好地識別甲磺隆并可以應用于實際水樣的液相色譜檢測；Peng Yan等[25]首先通過硅烷化作用將雙鍵嫁接在二氧化硅納米顆粒的表面，合成了甲磺隆MIPs涂層的二氧化硅納米顆粒，可應用于土壤、大米、大豆和谷物樣品中甲磺隆、氯磺隆、苯磺隆和噻吩磺隆的檢測；王寧[26]和Dong Xiaochao[27]等采用紫外光引發溶液聚合法合成了單嘧磺隆MIPs，并被成功地用作固相提取劑對土壤樣品中的單嘧磺隆進行有效富集與凈化；鄭亞麗等[28]制備了氯磺隆MIPs微球，可作為固相萃取填料用于檢測煙葉中6種磺酰脲類除草劑；李蓉等[29]建立了復合分子印跡固相萃取-高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜同時檢測多種植物源性食品中3種磺酰脲類除草劑殘留的分析方法。然而這些方法只能對特定幾種磺酰脲類農藥進行檢測，適用范圍窄，目前各種農產品中使用磺酰脲除草劑的種類高達30多種，現有的方法都無法滿足快速檢測29種，因此開發高通量高效樣品前處理技術的一步式檢測29種磺酰脲類具有很好的研究價值。

因此，本研究利用雙模板分子，采用沉淀聚合法制備了磺酰脲類MIPs，研究聚合物的吸附性能，并將其作為填料制備MI-SPE柱，建立農產品中29種磺酰脲類除草劑殘留量測定的MI-SPE/HPLC-MS/MS。與已有文獻相比[22-29]， 本實驗建立的MI-SPE/HPLC-MS/MS方法具有前處理簡單、選擇性好、回收率高、檢測限低、靈敏度高、一次處理樣品可檢測29種磺酰脲類農藥殘留的特點。該方法可用于農產品中29種磺酰脲類除草劑的殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷物、蔬菜、水果、食用油等農產品為北京市購；4-乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine，4-VP）、二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB） 上海Aladdin公司；偶氮二異丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN） 北京百靈威 公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純），甲酸、冰乙酸、磷酸（均為分析純） 美國Thermo Fisher Scientific公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀三水合物（均為分析純） 北京化學試劑公司；超純水由法國 MilliQ純水機制備；29種磺酰脲類農藥標準品：芐嘧磺隆、苯磺隆、煙嘧磺隆、氯磺隆、噻吩磺隆、單嘧磺隆、胺苯磺隆、氯吡嘧磺隆、甲磺胺磺隆、甲基碘磺隆鈉鹽、醚苯磺隆、乙氧嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆、氟唑磺隆、嘧苯胺磺隆、酰嘧磺隆、甲磺隆、噻苯隆、氟吡磺隆、環丙嘧磺隆、醚磺隆、砜嘧磺隆、氟磺隆、氟胺磺隆、甲嘧磺隆、氟嘧磺隆、磺酰磺隆、甲酰胺磺隆（純度均大于98%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設備

1200液相色譜儀、API5000串聯四極桿質譜儀 美國Agilent公司；MS200型多管渦旋混勻儀 杭州瑞誠儀器有限公司；AL104型電子天平 瑞士梅特勒-托利多 公司；Biofuge Stratos型臺式高速冷凍離心機 美國 Thermo公司；ZK-82A型真空干燥箱 上海路達公司；KQ2200DB3L型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司； D10-12型干熱式氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磺酰脲類MIPs的合成

將甲磺隆和氯磺?。ㄎ镔|的量比為1∶1）置于150 mL的圓底燒瓶中，加入一定量的乙腈溶解，待模板分子完全溶解后加入4-VP（與模板分子物質的量比為4∶1），置于搖床上預聚合60 min。加入DVB（與模板分子的物質的量比10∶1）和一定量的引發劑AIBN，超聲10 min，充氮氣除氧10 min，密封后放入60 ℃水浴鍋振蕩 （140 r/min）反應24 h。反應結束后，過濾得到沉淀，用甲醇沖洗2～3 次，55 ℃真空干燥。之后在索氏提取器上用乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液洗脫模板，直至紫外分光光度計檢測不到模板分子。非分子印跡聚合物（non molecularly imprinted polymers，NIPs）的制備除不加模板外，其余步驟與MIPs）相同。

1.3.2 聚合物的吸附性能表征

選取6種主要的磺酰脲類農藥對其進行吸附性能研究。分別稱取MIPs和NIPs 40 mg置于2 mL離心管中，加入1 mL不同質量濃度的磺酰脲類溶液，恒溫振蕩9 h，離心取上清液，HPLC測定其質量濃度，根據式（1）計算MIPs和NIPs對不同質量濃度磺酰脲類農藥的吸附量Q，并繪制等溫吸附曲線。根據式（2）Scatchard方程計算印跡聚合物的結合常數及最大表觀吸附量：

式中：Q為平衡時聚合物對分析物的吸附量/（μg/g）；Qmax為最大表觀吸附量/（mg/g）；C0為磺酰脲類農藥初始質量濃度/（mg/L）；Ce為平衡時上清液中磺酰脲類農藥質量濃度/（mg/L）；V為加入磺酰脲類溶液的體 積/mL；m為加入聚合物的質量/mg；Kd為平衡離解常數。

1.3.3 分子印跡固相萃取方法的建立

采用濕法裝柱的方式，在保證吸附效率的同時考慮經濟效益，故選擇填柱量為40 mg；由于MIPs在水中的分散性不佳，選擇2 mL乙醇為溶劑（柱上下兩端的篩板壓的力度要適中，太實會導致阻力大，溶液不能自然滴落；太松會導致目標物不能與聚合物充分接觸，從而使吸附量降低），制備磺酰脲類MI-SPE柱。活化：3 mL甲醇-3 mL水，并確保水在柱中未完全流干；上樣：準確吸取1 mL pH 8.0的PBS樣品溶液作為上樣液，流速為 1 mL/min；淋洗：1 mL水淋洗，流干；洗脫：3 mL 乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液為洗脫液洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，氮氣吹干，1 mL乙腈再次復溶后，經0.22 μm微膜過濾，待測。

1.3.4 實際樣品檢測

1.3.4.1 提取

玉米、大豆油：準確稱取均質后的樣品2.0 g于50 mL離心管中，加入10 mL超純水、10 mL乙腈溶液、4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉；高速勻漿5 min，靜置30 min，4 000 r/min離心5 min；10 mL乙腈溶液提取步驟重復3 次，合并上清液；完全轉移上清液于圓底燒瓶中，加入15 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋5 min，靜置10 min，分層；棄去上層正己烷層，將下層乙腈層旋轉蒸發濃縮至近干；加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）復溶，待凈化。

黃瓜、梨：準確稱取均質后的樣品2.0 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈溶劑、4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉；高速勻漿5 min，靜置30 min，4 000 r/min離心5 min；乙腈溶劑提取步驟重復3 次，合并上清液，完全轉移上清液于圓底燒瓶中，旋轉蒸發濃縮至近干；加入2 mL PBS復溶，過0.22 μm有機濾膜，待凈化。

1.3.4.2 凈化

按照優化好的步驟進行活化、1 mL上樣液上樣、淋洗、洗脫程序。洗脫液氮吹后用1 mL乙腈進行復溶，過0.22 μm有機濾膜，通過HPLC-MS/MS檢測回收率。

1.3.5 色譜條件

Shim-pack GIST C18色譜柱（75 mm×2.1 mm，2 μm），柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，進樣體積1 μL，流動相組成及梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相組成及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase composition and gradient elution conditions

1.3.6 質譜條件

電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源，毛細管電壓為4 000 V，毛細管溫度為300 ℃，霧化氣流量為3.0 L/min，碰撞氣類型為氬氣，檢測方式：多反應監測，質譜參數條件見表2。

表2 質譜參數Table 2 MS parameters

2 結果與分析

2.1 磺酰脲類MIPs制備條件的優化

首先對模板分子進行選擇。由于有30余種商用的磺酰脲類除草劑，因此開發一種具有良好凈化效果的類特異性分子印跡-固相萃取方法，用于同時測定復雜基質中的多種磺酰脲類除草劑，作為理想和實用的常規監測。雙模板分子印跡策略最近被證明是一種有效的方法，因為采用雙模板分子可以在一種MIPs中產生多重識別位點，同時提供更大的吸附容量。模板分子是MIPs中最重要的部分，它的結構直接影響所得聚合物的性質[30-33]。甲磺隆和氯磺隆是最開始被開發使用的磺酰脲類除草劑，其他種類的磺酰脲類除草劑都是在其結構基礎上進行取代基的改變而合成的。基于甲磺隆和氯磺隆的結構特性以及良好的熱穩定性，故選擇二者作為雙模板分子，使其與功能單體通過共價或非共價鍵的相互作用形成穩定的復合物。從圖1可看出，采用雙模板 （甲磺隆∶氯磺隆=1∶1，n/n）作為模板分子制備的聚合物對目標物的吸附量遠大于單模板，證明了采用雙模板分子可以在一種MIPs中產生多重識別位點，同時提供更大的吸附容量。根據模板分子和功能單體的分子結構，推測其原理可能是由于功能單體的吡啶基團和模板分子磺酰脲橋上的質子之間形成了氫鍵，也可能是功能單體的芳香族基團和模板分子之間的π-π相互作用導致。

圖1 不同模板分子的比較Fig. 1 Effect of different template molecules on adsorption capacity of MIPs for sulfonylurea pesticides

采用沉淀聚合法，按照表3聚合體系進行篩選和優化，確定了聚合物的制備體系。結果表明：以甲磺隆和氯磺隆1∶1混合為模板分子，4-VP為功能單體，DVB為交聯劑（三者物質的量比為1∶4∶10），乙腈為致孔劑時，制備的聚合物吸附量最高，此時可獲得對磺酰脲類農藥具有較好的特異性識別性能和吸附容量的MIPs，故選擇此體系為聚合物的最終制備體系。其原理可能是由于功能單體的吡啶基團和模板分子磺酰脲橋上的質子之間形成了氫鍵，也可能是功能單體的芳香族基團和模板分子之間的π-π相互作用導致。

表3 聚合物制備體系的優化Table 3 Optimization of polymerization system

2.2 磺酰脲類MIPs的表征

采用掃描電鏡對聚合物的表面形貌和結構進行表征。以甲磺隆和氯磺隆為雙模板分子，4-VP為功能單體，DVB為交聯劑（三者物質的量比例為1∶4∶10），30 mL乙腈作為致孔劑，采用沉淀聚合法制備的MIPs和NIPs。從圖2可以看出，MIPs粒徑均勻，大約在0.1 μm，而NIPs顆粒不規則，且表面光滑。而MIPs與NIPs團聚體中顆粒的平均尺寸不同，可以表明模板分子在沉淀聚合的成核階段有影響，在印跡過程中印跡位點的形成起到重要作用。

圖2 MIPs（a）和NIPs（b）的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron micrographs of MIPs (a) and NIPs (b)

2.3 磺酰脲類MIPs的吸附性能

根據不同磺酰脲類除草劑的分子結構特征，選擇6種典型的磺酰脲類農藥進行靜態及動態吸附，獲得了在2.1節確定的最優聚合體系下制備聚合物的最大表觀吸附量及結合常數，根據聚合物的靜態吸附曲線和動態吸附曲線對聚合物的特異性進行評價。由圖3可知，不同的磺酰脲類農藥動態吸附曲線趨勢相同，該6種目標物在9 h之前動態曲線隨著時間的延長呈上升趨勢，而9 h之后曲線均可達到平衡，故選擇9 h作為飽和吸附時間。由圖4可知，聚合物在PBS（pH 8.0）中對目標物具有很好的吸附性能，而且隨著磺酰脲類目標物初始質量濃度的逐漸增大，聚合物的吸附容量逐漸增大。

圖4 MIPs的靜態吸附曲線 Fig. 4 Adsorption isotherms of MIPs for sulfonylurea pesticides

由Scatchard方程（圖5）可知，Q/Ce與Q整體呈線性關系，Scatchard圖是由兩部分組成，分別為兩條斜率不同的線性直線。這表明MIPs中的結合位點在親和力方面是異質的（特異性和非特異性結合位點）。根據擬合的線性方程可以計算得出MIPs中結合位點的結合常數Kd以及對應的最大表觀吸附量Qmax，計算結果如表4所示，從結果可以看出MIPs對磺酰脲類農藥具有良好的吸附性能，其最大表觀結合量為13.21 mg/g。

表4 聚合物結合位點的結合常數Kd以及對應的最大表觀吸附量QmaxTable 4 Kd and Qmax for binding of sulfonylurea pesticides to MIPs

圖5 MIPs的Scatchard方程Fig. 5 Scatchard equations for adsorption of sulfonylurea pesticides by MIPs

2.4 印跡聚合物類特異吸附性

為考察磺酰脲類MIPs的類特異吸附性能，選擇三嗪類（莠去津）、三唑類（滅菌唑）和有機磷類（草甘膦）農藥作為競爭底物，采用平衡靜態吸附實驗，通過HPLC法測定聚合物對包括磺酰脲類在內的四大類典型農藥的吸附量。MIPs和NIPs的類特異性吸附結果如圖6所示。其中MIPs對磺酰脲類、三嗪類、三唑類和有機磷類農藥的吸附量分別為2.2、0.8、0.4 mg/g和0.59 mg/g，NIPs分別為1.4、0.3、0.18 mg/g和0.23 mg/g。MIPs對磺酰脲類農藥的吸附量明顯高于其他3 類農藥，表明制備的印跡聚合物對目標分子（磺酰脲類除草劑）具有類特異性吸附的能力。

圖6 MIPs類特異性吸附結果Fig. 6 Specific adsorption of sulfonylurea pesticides on MIPs

2.5 磺酰脲類分子印跡固相萃取條件的優化

為得到具有較好特異性吸附和富集效果的MI-SPE方法，對MI-SPE方法的參數進行優化。

首先，選擇不同的上樣液（乙腈、甲醇、PBS（pH 8.0）、乙腈-PBS（1∶9，V/V，pH 8.0）、乙腈-PBS（1∶1，V/V，pH 8.0）、乙腈-PBS（9∶1，V/V，pH 8.0））以研究目標分析物在MI-SPE柱中的保留效果（圖7）。結果表明，當選擇PBS（pH 8.0）為上樣液時，目標分析物在MI-SPE柱上的保留效果最好。盡管乙腈是聚合過程中的致孔劑，但當上樣液中含有乙腈和甲醇時，目標分析物在柱中的保留效果降低。

圖7 不同上樣液間的比較Fig. 7 Effect of different loading solutions on recoveries of sulfonylurea pesticides

為減少樣品基質中雜質的干擾，選擇超純水、乙腈和甲醇作為淋洗液，以進一步優化淋洗液。如圖8a所示，當使用乙腈和甲醇作為淋洗液時，目標分析物會不同程度地被洗掉，導致回收率降低，而當選擇超純水作為淋洗液時，可以最大程度地提高目標分析物與結合位點之間的特異性相互作用，并減少非特異性相互作用。由于乙腈和甲醇均可以不同程度從固相萃取柱上洗脫目標分析物，因此，在考察洗脫液時，不僅選擇酸化的甲醇，而且選擇不同體積的乙腈和甲醇作為洗脫液，對回收率進行比較。如圖8b所示，使用3 mL乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液作為洗脫液可確保目標分析物高回收率，故選擇3 mL乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液作為洗脫液。

圖8 不同淋洗液（a）和洗脫液（b）間的比較Fig. 8 Effect of different washing solutions (a) and elution solutions (b) on recoveries of sulfonylurea pesticides

最終確定的磺酰脲類MI-SPE柱萃取方法為稱取40 mg聚合物，以該聚合物作為固相萃取填料，濕法填柱制備了MI-SPE柱?？刂屏魉? mL/min，以3 mL甲醇、3 mL水為活化液，以1 mL的PBS（pH 8.0）樣品溶液為上樣液，1 mL純水作為淋洗液，3 mL 10%乙酸-甲醇為洗脫液，此條件下磺酰脲類目標物回收率最高。

2.6 方法學評價

配制6種系列質量濃度的29種磺酰脲類農藥混合標準溶液進行HPLC-MS/MS測定（2、5、10、20、50 μg/L 和100 μg/L），以各組分的3 次平均峰面積（Y）對質量濃度（X，μg/mL）繪制標準曲線，HPLC-MS/MS的線性關系和相關系數見表5。結果表明，29種磺酰脲類除草劑在2～100 μg/L范圍內線性非常好，相關系數R2＞0.999，由此可見，本實驗方法可滿足定量分析要求。

表5 29種磺酰脲類除草劑HPLC-MS/MS測定線性關系Table 5 Linear equations for quantitation of 29 sulfonylurea herbicides with HPLC-MS/MS

續表5

向空白農產品基質中添加29種磺酰脲混合標準溶液，添加量為10、20 μg/kg和50 μg/kg，3個平行，按照1.3.4節的方法進行前處理，用HPLC-MS/MS進行檢測。由表6可知，29種磺酰脲類農藥在4種不同農產品中的平均回收率在74.8%～110.5%之間，相對標準偏差（n=3）在0.4%～5.3%之間。以方法的最低添加量為定量限（limit of quantitation，LOQ），農產品中29種磺酰脲類農藥的LOQ為10.0 μg/kg。

表6 不同農產品中29種磺酰脲類農藥的回收率、相對標準偏差和LOQ（n= 3）Table 6 Recoveries, RSDs and LOQs of 29 sulfonylurea herbicides in different agricultural products (n = 3)

2.7 不同檢測方法的比較

從樣品制備、分離檢測技術、分析物個數、基質、線性范圍、回收率等方面與其他檢測磺酰脲類藥物的方法進行比較。如表7所示，開發的MIP-SPEHPLC-MS/MS方法具有靈敏度高、精密度好、檢出限低的優點?？捎糜趶碗s農產品中29種磺酰脲類藥物的特異性檢測。

表7 本研究與其他方法測定磺酰脲類除草劑的比較Table 7 Comparison of HPLC-MS/MS with other methods for the determination of sulfonylurea herbicides

3 結 論

利用甲磺隆和氯磺隆為雙模版分子，以4-VP為功能單體，DVB為交聯劑，乙腈為致孔劑，采用沉淀聚合法制備了磺酰脲類MIPs。實驗對聚合物選擇性吸附效果進行評價，表明聚合物對磺酰脲類農藥具有良好的選擇性和吸附性。以此聚合物為填料制備的MI-SPE柱對不同農產品樣品中29種磺酰脲類農藥進行分離富集，大大降低了HPLC-MS/MS檢測中的基質干擾。本實驗建立的29種磺酰脲類農藥的分析方法將樣品的提取、凈化和富集一步進行，節約了樣品前處理時間，減少了有機試劑的應用，且方法的準確度、精密度及靈敏度均滿足殘留檢測要求，可用于實際樣品的檢測。