固相萃取結合高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中那西肽殘留

2022-03-05 08:54:48肖陳貴沈金燦朱萍萍趙鳳娟郭偉杰康海寧岳振峰

食品科學 2022年4期

肖陳貴，沈金燦，朱萍萍，趙鳳娟，郭偉杰，康海寧，岳振峰

（深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，深圳市食品安全檢測技術研發重點實驗室，廣東深圳 518045）

那西肽是一種帶5個噻唑環的含硫多肽類抗生素，分子式為C51H43N13O12S6，由12個氨基酸及其衍生物組成，于1961年由法國科學家在鏈霉素的發酵液中發現[1-3]。那西肽具有抗病毒、抗菌的作用，對動物有明顯的促生長作用，已被作為一種良好的動物添加劑廣泛應用于畜禽養殖業[4]。1998年我國將其批準為國家3 類新獸藥[5]，農業部公告第168號明確將那西肽作為飼料藥物添加劑[6]。藥物性添加劑長期或過量濫用及不遵循休藥期使用，會對細菌耐藥，且緩慢蓄積引起器官的功能紊亂，對動物及人類健康產生危害[7]。為保障動物性食品安全，農業部第278號公告中規定了那西肽雞的休期為7 d，且產蛋期禁用[8]；其他國家如日本，規定了雞和豬的肌肉、肝臟等組織那西肽的最高殘留限量均為30 μg/kg[9]。近年來多肽類抗生素的殘留逐漸受到關注，建立雞蛋中那西肽殘留的監測方法，對保障動物源性食品的安全具有重要意義。

目前報道的那西肽殘留分析方法有高效液相色譜紫外檢測法[10-11]、高效液相色譜熒光檢測法[12-16]、氣相色譜-質譜聯用法[17]、液相色譜-串聯質譜法[18]等，研究對象包括制劑、飼料、動物肌肉、肝臟和腎臟組織等[10-18]，雞蛋基質中那西肽的殘留分析鮮見報道。由于那西肽禁止用于產蛋雞，高效液相色譜法存在靈敏度較差、抗干擾能力不強、無法確證分析能力等缺點，難以滿足雞蛋中那西肽的殘留要求；采用氣相色譜-質譜測定，方法的前處理需進行衍生，操作復雜且穩定性較差。近年來，高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法檢測方法在痕量分析中得到廣泛應用[18-20]，特別是對于多肽類抗生素殘留測定十分常見[21-25]，如王玉琴等[22]使用液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中萬古霉素、去甲萬古霉素和桿菌肽A，劉佳佳等[23]采用液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中5種多肽類抗生素。采用液相色譜-串聯質譜法測定那西肽面臨的一大困難是那西肽的碎片離子信號強度低[21]，難以直接測定；為此，Song Xuqin等[21]采用堿水解法通過間接分析那西肽的降解產物HMIA而實現了那西肽的液相色譜-串聯質譜測定，該方法實驗過程相對繁瑣，且測定的目標物為降解產物而非那西肽原型，容易引起誤判。目前鮮見那西肽液相色譜-串聯質譜法直接測定的報道。因此，本實驗建立那西肽HPLC-MS/MS直接測定法，并結合固相萃取技術實現雞蛋中痕量那西肽的快速、靈敏、準確測定，旨在為雞蛋中那西肽的殘留監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋市購。

甲醇、乙腈、正己烷、乙酸銨（均為色譜純），二甲基亞砜（分析純）上海安譜實驗科技股份有限公司；甲酸（分析純）江蘇永華化學股份有限公司；無水硫酸鈉（分析純）上海國藥集團化學試劑有限公司；那西肽標準品（純度77.6%）廣州碩譜生物科技有限公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

LCMS-8050型液相色譜-串聯質譜儀、DGU-20A5R高效液相色譜儀日本島津公司；Accucore RP-MS色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）美國Fisher科技公司；HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg，使用前用3 mL甲醇活化）美國Waters公司；3K18型離心機德國Sigma公司；5982-9120固相萃取裝置美國Agilent公司；TurboVap LV型氮吹濃縮儀瑞典Biotage公司；EOFO-945066型漩渦混合器美國Talkboys公司；0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取那西肽12.9 mg，用250 μL二甲基亞砜溶解，乙腈定容至50 mL，制得200 μg/mL標準儲備溶液，-20 ℃避光保存，有效期為2個月。將質量濃度為200 μg/mL的標準溶液，用乙腈稀釋為5 μg/mL的標準中間液，-20 ℃下避光保存，有效期為1個月。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 樣品制備雞蛋樣品，經高速組織搗碎機均勻搗碎，裝入干凈容器內，加封后做好標記，將試樣于-20 ℃保存。

1.3.2.2 樣品前處理

準確稱取2 g（精確到0.01 g）均質試樣，于50 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入8 mL 1%甲酸-乙腈提取液，渦旋振蕩10 min，9 500 r/min離心5 min，取上清液于另一50 mL離心管中，加入8 mL 1%甲酸-乙腈再次提取，渦旋振蕩10 min，離心5 min，合并2 次提取液，加入水定容至20 mL，混合均勻。準確吸取10 mL混合提取液于15 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入3 mL乙腈飽和正己烷，上下輕搖20 次，9 500 r/min離心5 min，收集乙腈層。收集液以1 s/滴的速率過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，抽干，收集全部流出液。流出液中加入1 g無水硫酸鈉，渦旋混合1 min，9 500 r/min離心5 min，靜置分層，取上清液于15 mL刻度玻璃管中。將上清液50 ℃吹氮濃縮至0.5 mL左右，加入含2%甲酸的乙腈溶液定容至1 mL，混勻，過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 檢測條件

HPLC條件：Accucore RP-MS色譜柱（100 mm× 2.1 mm，2.6 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積20 μL；流動相A：10 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B：乙腈；流速200 μL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，70% A，30% B；1～5 min，流動相B線性增至90%，保持1 min；6.1～8 min，70% A，30% B。

MS條件：電噴霧離子源，負離子模式；碰撞氣為氬氣；多反應監測（multiple teaction monitoring，MRM）；霧化器流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；接口溫度300 ℃；脫溶劑溫度526 ℃；傳輸線溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；干燥氣流量10 L/min；其他質譜參數見表1。

表1 那西肽質譜參數Table 1 Parameters of mass spectrometry for the determination of nosiheptide

1.4 數據處理

采用日本島津公司的Labsolutions軟件對檢測數據進行處理，采用Excel軟件對結果進行分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 提取溶液的選擇

雞蛋中含有大量的脂肪、蛋白質、不飽和脂肪酸等，基質復雜。乙腈具有極性適中、穿透力強的特點，常被用于樣品中那西肽的提取[12-15]；此外，由于雞蛋中含有大量蛋白質，采用乙腈進行提取可以快速將蛋白質變性，減少蛋白質的干擾。實驗曾參考文獻[12-15]采用純乙腈作為提取溶劑，結果發現采用純乙腈提取回收率低；考慮到溶液的酸堿性對樣品提取效果有很大影響，因此實驗進一步比較了1%甲酸-乙腈、1%氨水-乙腈及純乙腈3種提取液對目標物的提取效率，結果如圖1所示。在加標質量濃度為10 μg/kg條件下，3種不同提取溶液提取效率有明顯差異。采用純乙腈提取其回收率在40%以下；在乙腈中加入酸或堿，均能有效提升提取效率，加入1%氨水，回收率提升到60%左右；而加入1%甲酸，回收率提高到80%以上，這可能是加入甲酸酸化后，蛋白質的極性增加，從而減少了變性蛋白質對那西肽的吸附，因而提取效率得到顯著提升。為進一步細化甲酸的用量，分別考察0.5%、1%、1.5%、2%和3%的甲酸溶液對目標物提取的影響，結果如圖2所示。當甲酸溶液體積分數低于1.5%時，回收率較高，在90%以上；超過1.5%時，回收率逐步下降。因此，最終選用1%甲酸-乙腈作為提取溶液。

圖1 不同提取液的提取效率Fig. 1 Effect of different extraction solvents on nosiheptide recovery

圖2 甲酸體積分數對回收率的影響Fig. 2 Effect of formic acid concentration on nosiheptide recovery

2.2 凈化條件的選擇

乙腈提取液中含有部分油脂，實驗采用正己烷對提取液進行脫脂，脫脂后的提取溶液呈淺黃色。為了進一步去除其中色素，實驗通過固相萃取柱去除，分別比較HLB、C18兩種固相萃取柱對回收率的影響。在加標量為10 μg/kg條件下，將提取液分別過2種不同固相萃取柱，考察其對回收率的影響。結果表明，2種固相萃取柱均具有較好的除色效果，過固相萃取液后提取液無色、透明、澄清；過柱后的回收率良好，C18的回收率為87%，HLB回收率為96%。因此，最終選擇HLB固相萃取柱進行凈化。

2.3 濾膜的影響

那西肽為多肽類物質，不同材料濾膜可能對回收率有較大影響。本實驗將5 μg/L標準溶液，分別過聚四氟乙烯膜和聚酰胺有機膜2種不同類型微孔濾膜。結果表明采用聚四氟乙烯膜回收率為94%，而采用常規的聚酰胺有機濾膜回收率僅為63%，該結果表明常用的聚酰胺膜對那西肽有較強的吸附作用。因此，實驗選擇聚四氟乙烯材質濾膜。

2.4 測定條件的優化

取0.5 mg/L標準溶液，以流動注射的方式在負離子模式下進行一級質譜全掃描，得到那西肽的準分子離子峰（[M-H]-）m/z1 220，[M-H]-母離子再通過二級質譜全掃描，[M-H]-離子在碰撞池發生碎裂產生不同的碎片離子（圖3），主要碎片有m/z1 176、1 017和973。Song Xuqin等[21]發現那西肽無論是采用電噴霧電離或大氣壓化學電離都只能得到低強度的碎片離子，本實驗也發現當碰撞能量小于30 eV時，無法得到有效的碎片離子；但是，在較高碰撞能量（45 eV）條件下，那西肽能夠通過碰撞得到多個明顯的碎片離子，如圖3所示。這可能是由于那西肽為環狀多肽，分子結構較為穩定，且分子較大（相對分子質量超過1 000），因此需要較高碰撞能量才能碎裂。對得到的主要碎片離子進行解析，結果如圖4 所示。發生碎裂的位置為酯基兩側和圖中標示的C—S鍵處，準分子離子[M-H]-丟掉碎片a得到[M-H-a]-，對應相對分子質量1 176；[M-H]-丟掉碎片b得到 [M-H-b]-，對應相對分子質量1 017；[M-H]-同時丟掉碎片a和碎片b得到[M-H-a-b]-，對應相對分子質量973。m/z973和m/z1 176豐度較高，故最終選擇作為定量、定性離子。以MRM負離子模式優化碰撞電壓、霧化器流量、加熱氣流量、脫溶劑溫度、加熱塊溫度、干燥氣流量等各質譜參數，得到最佳質譜條件見表1。

圖3 那西肽質譜圖Fig. 3 MS/MS spectrum of nosiheptide

圖4 那西肽質譜碎裂途徑Fig. 4 Fragmentation pathways of nosiheptide

那西肽為多肽類抗生素，分子上帶有多個氨基和羥基等極性基團，流動相的緩沖鹽對其在色譜的保留及質譜響應有重要影響。常用的有機相有甲醇和乙腈，由于那西肽在乙腈中具有較好的溶解性，因此選擇乙腈作為有機相。那西肽質譜檢測采用負離子模式，中性或偏堿環境更有利于質譜負離子的產生，因此采用質譜檢測中常用的醋酸銨溶液作為水相，該溶液能夠將溶液pH值有效控制在中性條件。在相同梯度洗脫條件下考察2、5 mmol/L和10 mmol/L醋酸銨溶液對質譜響應的影響，結果如圖5所示。該結果表明10 mmol/L醋酸銨作為水相時響應最高，即較高濃度的醋酸銨有利于質譜響應的提高，這主要是溶液中的醋酸根離子有助于負離子的產生[26-27]，但高濃度的鹽溶液容易在質譜錐孔沉積而導致堵塞，因此最終采用10 mmol/L醋酸銨作為水相。采用優化后的梯度洗脫條件，實現了5 min內那西肽的快速測定。

圖5 醋酸銨水相質量濃度對質譜信號強度的影響Fig. 5 Effect of aqueous phase concentration of ammonium acetate on mass spectrometric signal intensity

2.5 基質效應

2.6 方法的線性范圍與檢出限、定量限

在空白樣品提取液中添加不同質量濃度的標準品（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L），采用本方法測定，以峰面積為縱坐標，對應質量濃度為橫坐標進行線性擬合，繪制基質匹配標準曲線，那西肽在1.0～20.0 μg/L質量濃度范圍內，線性關系良好，線性方程為y=710.936x-168.718，線性相關系數R2大于0.998。在最低添加水平下，以3 倍和10 倍信噪比結合濃度外推法確定方法的檢出限和定量限，那西肽的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。雞蛋樣品添加1.0 μg/kg的MRM色譜圖如圖6所示。

圖6 雞蛋中加標1.0 μg/kg那西肽的MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatogram of egg samples spiked with 1.0 μg/kg nosiheptide

Song Xuqin等[21]采用液相色譜-串聯質譜法通過測定那西肽堿水解產物4-羥甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸實現豬、雞和魚等動物組織中那西肽的測定，方法的定量限為2.0 μg/kg，回收率為85%～108%。與該方法相比，本方法通過對那西肽完整化合物進行HPLC-MS/MS分析，方法更為直接、簡便，不容易導致假陽性，且靈敏度也更高。

2.7 樣品測定

以不含有那西肽的雞蛋樣品作為空白樣品，在空白雞蛋樣品中分別添加1.0、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg那西肽標準，每個添加水平平行測定6個樣品，進行回收率和相對標準偏差檢測，結果如表2所示。在添加量范圍內，那西肽的平均回收率為83.8%～96.2%，相對標準偏差為6.0%～8.8%。陳慧華等[15]采用高效液相色譜法測定動物肌肉、肝臟組織中那西肽殘留量，平均回收率為73.8%～93.0%，相對標準偏差為1.3%～11.1%；Song Xuqin等[21]采用液相色譜-串聯質譜法測定豬、雞和魚等動物組織中那西肽殘留，回收率為85%～108%；與兩者相比，本方法的準確度基本處于同一水平。采集深圳地區不同超市的10 份雞蛋樣品采用本方法進行檢測，未在樣品中檢出那西肽殘留。