基于SSR標記技術對3種國產綿羊肉的品種鑒別分析

宋亞倩，楊 波，羅瑞明，馬小梅

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

綿羊品種的遺傳資源是人類生存的寶貴基因庫之一，也是綿羊繁殖不可或缺的重要遺傳物質[1]。中國有42種以上的地方綿羊品種，地方綿羊品種是長期進化和勞動人民精心選育的結果，具有適應性好、抗逆性強、多態性豐富等特點，它們是中國現在和未來不可缺少的寶貴遺傳資源[2]。藏綿羊性喜冷涼干旱，耐高寒、耐干旱性能好[3]，飼養經濟效益高，因此飼養數量大、分布廣，以藏西北、藏東南干旱、半干旱地區為集中，是具有青藏高原特色的品種資源[4]。新疆細毛羊是伊犁草原上的明珠，是新中國成立后命名的第1個細毛羊新品種[5]。它的育成，不僅填補了我國養羊業的一個空白，而且對推進細毛羊的品種改良具有重要影響。寧夏灘羊是中國寧夏優勢特色畜種[6]，灘羊肉質細嫩多汁，不膻不腥，是公認的優質羊肉，灘羊在寧夏養殖比例較高，經濟效益顯著，素有“寧夏五寶之一”的美稱[7]。

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）又稱微衛星DNA、短串聯重復序列，由1～6個堿基串聯重復序列形成，是一種基于DNA長度多態性的分子標記技術[8-9]。SSR位點廣泛分布于所有原核生物和真核生物基因組中，具有分布豐富性、遺傳共顯性和技術簡單性等特點[10]。基于DNA序列側翼序列設計引物，可以對SSR位點進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增鑒定，形成富有極高進化信息的分子標記。微衛星DNA以多拷貝方式廣泛分布在各類真核生物的基因組中，通過對SSR位點進行開發并設計特異性引物，分析目的片段多態性，能夠建立綿羊品種特異性檢測方法[11]。趙杰[12]根據性狀相關基因挑選了等位基因頻率在普通肉牛群體中為0.546～0.833、在牦牛群體中為0.009～0.075的10個SSR位點，樣本經PCR擴增，毛細管電泳分離后，根據出峰數目進行肉源判定。岳遠瑞等[13]分析新疆北疆地區主要綿羊品種的遺傳多樣性和系統發生關系，利用SSR Hunter軟件尋找5個微衛星標記，采用PCR擴增、1%瓊脂糖凝膠電泳，對新疆7個品種綿羊群體遺傳多樣性進行檢測分析，結果顯示，新疆7個綿羊群體共發現28個等位基因，實驗證明在5個微衛星位點的平均多態信息含量為0.556 9～0.733 5，均屬于高度多態性位點。隋宥珍等[14]分析柔魚、阿根廷滑柔魚、莖柔魚3種柔魚類多態性微衛星標記在種間的通用性，結果表明，莖柔魚類多態性SSR標記在柔魚中具有較高的通用性。Yin等[15]根據線粒體12S rRNA基因序列，提出了一種基于多重PCR的方法，利用設計的3個引物對牦牛肉和牛肉進行快速鑒定，通過3個引物與單一反應集的組合使用，從牛肉DNA中擴增出290 bp和159 bp的2個片段，用該方法為牦牛肉及肉制品的質量控制提供了有效手段。

本研究提取純種寧夏灘羊、藏綿羊與新疆細毛羊的肝臟DNA并進行文庫構建，根據文庫測序結果，從3種綿羊肉基因組SSR標記入手，確定不同的候選特異DNA序列，據此設計SSR引物，采用PCR技術，用特異性SSR引物對寧夏灘羊肉、藏綿羊肉和新疆細毛羊肉進行物種鑒別。從基因水平研究寧夏灘羊、藏綿羊與新疆細毛羊之間科學準確的鑒定方法是西部地區綿羊肉產業發展亟需解決的技術問題。這不僅能保護消費者權益，而且對于綿羊肉產業的穩定、健康發展以及科學開發利用均具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用純種寧夏灘羊的肝臟來自大夏牧場（寧夏鹽池縣），純種藏綿羊和純種新疆細毛羊的肝臟來自天祝藏族自治縣鑫榮盛生態養殖有限公司（甘肅省武威市）。

TaqPlus DNA聚合酶、10×PCR Buffer（含Mg2+）、dNTP（10 mmol/L）、引物、Rapid Animal Genomic DNA Isolation Kit、QubitTMdsDNA HS Assay Kit、NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司；6×DNA Loading Dye、DNA Ladder Mix（100～3 000 bp）、POP-7TMPolymer、Applied BiosystemsTMHiDiFormamide 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設備

PCR儀、測序儀 美國ABI公司；凝膠成像儀 上海復日科技有限公司；臺式高速離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；BP系列精密單道可調移液器 加拿大BBI公司；紫外-可見分光光度計 美林恒通（北京）儀器有限公司；Qubit 4.0熒光定量儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細毛羊各20 只，分別多點取其肝臟不同部分，每只綿羊肝臟樣本25 g，采樣完成后將每只綿羊肝臟分裝，共計60個樣本。采樣過程中注意避免外源性污染。

1.3.2 DNA提取

參照DNA提取試劑盒說明書提取3個品種綿羊的肝臟DNA[16]，通過1%瓊脂糖凝膠（電壓200 V、電泳時間30 min）檢測DNA完整性，DNA提取后保存于-20 ℃備用。

1.3.3 基因組文庫構建、擴增、純化和質控

利用dsDNA HS Assay Kit對基因組濃度精確定量確定文庫構建所加入的DNA總量[17]。以NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進行文庫構建。于無菌PCR管中（200 μL）配制反應體系，對純化后的接頭連接產物進行PCR擴增富集。通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用熒光定量儀進行文庫濃度測定，得到均勻的長簇效果和高質量的測序數據。

1.3.4 SSR位點開發

在獲取拼接基因組序列后，使用MISA軟件對序列中的SSR位點進行檢測，SSR最小間距為200 bp，SSR選取標準分別為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和復合重復序列[18]。最小數量分別為10、6、5、5、5、5和5。在獲得SSR序列信息后，使用Primer 3.0對SSR序列進行引物設計，獲得綿羊引物庫。隨機挑選100 對引物，此100 對引物擴增完成時片段長度處于100～280 bp之間，平均片段大小為172 bp。用篩選出的100 條SSR引物對分別對3種樣品的DNA進行PCR擴增。

1.3.5 SSR擴增和毛細管電泳檢測

PCR體系：引物F：10 μmol/L（20～50 ng/μL），1 μL；引物R：10 μmol/L（20～50 ng/μL），1 μL；dNTP（mix）：10 μmol/L（20～50 ng/μL），1 μL；TaqBuffer（含MgCl2）：10×（20～50 ng/μL），0.2 μL；Taq酶：5 U/μL（20～50 ng/μL），0.5 μL；加入ddH2O 25 μL。

PCR條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環以上步驟10 次。94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環以上步驟35 次。72 ℃修復延伸5～8 min。

通過6-羧基熒光素和6-羧基四甲基羅丹明熒光標記獲得的SSR引物并通過PCR擴增后，使用毛細管電泳檢測SSR分型，最后使用Genemapper軟件整理并分析SSR數據，導出每對引物的pdf峰圖文件，篩選并保留具有多態性且能夠產生高度特異性擴增片段的微衛星標記引物。

1.3.6 多態性檢測和數據處理

從預實驗結果中挑出具有多態性的引物，對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊（共計60個樣本）進行遺傳多態性檢測。通過GenAIEx軟件計算各微衛星位點的平均等位基因數（alleles number，Na）、平均有效等位基因數（effective alleles number，Ne）、平均觀測雜合度（observed het-erozygosity，Ho）、平均期望雜合度（expected heterozygosity，He），并使用POPGENE 3.2軟件計算各微衛星位點的多態信息含量（polymorphism information content，PIC）[19-20]。Na是反映群體遺傳變異大小的一個指標，等位基因數越多，其多態性越高。Ne是基因一致度的倒數，反映等位基因間的相互影響，也可作為群體遺傳變異的一個測度[21]。He主要是根據種群內當前優勢等位基因的分布頻率來推算；Ho是隨機抽取兩個樣本的等位基因不相同的概率。雜合度能夠反映基因多樣性，群體的雜合度表示某位點為雜合子的 概率[22]。PIC最初用于連鎖分析時對標記基因多態性的估計[23]，現常用來表示微衛星多態性高低的程度[24-25]。

1.3.7 特異性引物的有效性與適用性檢驗

將篩選出的特異性引物用于寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的肌肉和肝臟鑒別中，檢驗特異性引物的有效性與適用性。純種寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細毛羊分別5 只，分別多點取其肝臟和肌肉的不同部分，每個樣本為25 g，采樣完成后將樣品分裝，共計30個樣本，品種對應分別標記。寧夏灘羊的肝臟標記為Liver 1～5，肌肉標記為Muscle 1～5；新疆細毛羊的肝臟標記為Liver 6～10，肌肉標記為Muscle 6～10；藏綿羊的肝臟標記Liver 11～15，肌肉標記為Muscle 11～15。分別提取肝臟DNA和肌肉DNA，用特異性引物對不同品種和部位的樣本進行SSR擴增和毛細管電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 DNA質量評估結果

A260nm/A280nm用于評估核酸樣品的純度[26]：純DNA的A260nm/A280nm為1.8[27]，如果比值低于1.8，則表示DNA被蛋白或酚類物質污染，需要純化DNA樣品[28]。凝膠電泳檢測條帶清晰說明完整性良好，若有拖尾或條帶呈彌散狀，則表明DNA存在不同程度的降解[29]。由表1可知，樣本所提取全基因組DNA質量濃度為 （128.4±0.02）ng/μL，總體積50 μL，樣本A260nm/A280nm為1.81±0.03，表明DNA未被蛋白或酚類物質污染。 圖1為DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，顯示樣本主條帶清晰，表明DNA分子無降解，完整性好，DNA質量滿足后續實驗要求。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig. 1 Electrophoresis profile of DNA

表1 DNA質量結果Table 1 Results of DNA quality

2.2 文庫構建結果分析

圖2為堿基含量分布折線圖，橫坐標表示讀序內相對位置，縱坐標為讀序中該位置堿基組成百分比，不同顏色折線表示不同堿基。依據測序原理[30]可知，在使用隨機打斷策略制備文庫時，如果文庫隨機性較好，則在讀序不同位置堿基組成分布比較均勻，反映到圖中為折線無較大波動[31-32]。由圖2可知，圖中的折線無較大波動，說明文庫隨機性較好，在讀序不同位置的堿基組成分布比較均勻，可以保證后續分析的數據質量。

圖2 堿基含量分布折線圖Fig. 2 Base composition distribution

2.3 SSR位點分布結果

使用MISA檢測序列中的SSR位點，Fast QC可視化SSR位點分析結果，共計46 557個有效SSR位點序列。如圖3所示，其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和復合SSR個數和占比分別為9 318（20.30%）、10 185（21.80%）、8 162（17.50%）、706（1.50%）、687（1.40%）、22（0.10%）和17 478（37.40%）。

圖3 綿羊基因組不同重復類型SSR的分布比例Fig. 3 Proportions of different repeat types of SSRs in ovine genome

由圖4氣泡圖和箱線圖可以清晰看出SSR的數目、分布和分布密度情況。發現p1～p6類型即單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的占比普遍較低，而c和c*類型，即復合SSR的占比及分布明顯高于其他核苷酸重復類型；復合重復基元種類豐富，要遠高于非復合SSR。觀察分析基因組中存在的復合重復基元發現，核苷酸重復基元組合差異明顯，主要包括(A)13(AA)6*、(A)12(AA)6*、(AA)6(A)13*、(A)14(AA)7*、(A)15(AA)7*(AAA)5*、(AA)7(A)14*等復合重復類型[33]。SSR位點的豐富度分布模式和占比情況與耿多等[34]利用MISA查找拼接序列SSR位點，分析SSR序列特征的結果相同。

圖4 綿羊基因組SSR重復單元分布箱線圖（A）和氣泡圖（B）Fig. 4 Boxplot (A) and bubbleplot (B) of SSR repeat unit distribution in ovine genome

2.4 SSR引物篩選結果

實驗選取分別來自寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊3個品種綿羊的DNA為模板，隨機挑選100 對引物，合成100 對引物進行擴增檢測。如圖5所示，在100 對引物中篩選出50 對在3種綿羊中具有不同程度明亮清晰度的引物用于后續實驗。引物序號分別為1、2、3、4、5、6、10、11、12、14、15、19、20、21、22、24、36、38、42、45、49、50、51、52、56、61、62、63、65、67、69、70、74、76、77、78、79、84、85、86、88、89、92、93、95、96、97、98、99、100（標注處為挑選的適宜引物）。

圖5 綿羊基因組SSR引物凝膠電泳圖Fig. 5 Electrophoresis profiles of PCR amplification productions of ovine genome with SSR primers

2.5 基因組SSR引物的篩選

在初步篩選的50 對引物中，根據擴增結果及毛細管電泳峰圖檢測結果發現，有10 對SSR引物成功擴增出穩定條帶，且具有豐富又穩定的多態性。該10 對引物詳細信息見表2，片段大小在102～269 bp之間，退火溫度在59～61 ℃之間。其余引物擴增不成功主要是由于出現了明顯雜帶或擴增產物片段與預期產物片段大小不符的情況[35]。

表2 綿羊基因組SSR引物信息Table 2 Information of SSR primers used for amplification of ovine genome

2.6 基因組SSR標記的多態性分析

將篩選的10 對基因組SSR引物，對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊共計60個樣本進行遺傳多樣性分析，10 對基因組SSR引物在寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊群體中均能檢測到多態性，但多態性水平有所不同。 表3為10個微衛星位點的遺傳多樣性參數，結果顯示，寧夏灘羊各參數平均值為Na 4.100、Ne 3.782、Ho 1.007、He 0.704、PIC 0.432，為中等多態性引物。新疆細毛羊各參數平均值為Na 3.100、Ne 2.747、Ho 1.009、He 0.615、PIC 0.414，為中等多態性引物。藏綿羊Na 3.600、Ne 3.193、Ho 0.953、He 0.660、PIC 0.425，為中等多態性引物。當Ne低于Na時，說明在基因組中存在一些高頻率的等位基因，以上結果表明，本研究獲得的10 對引物存在高頻率的等位基因，擴增的SSR位點豐富。10 對引物在3個綿羊群體有較高的遺傳多樣性水平，其中寧夏灘羊在10個SSR位點的遺傳多態程度要高于藏綿羊和新疆細毛羊，表明多態性微衛星標記的選用對群體統計指標具有較大的影響。PIC存在差異可能是有兩方面的原因：一方面可能是使用的微衛星標記的種類和具體位點不同；另一方面可能是檢測方法所產生的遺傳多態性差異。

表3 10個微衛星位點的遺傳多樣性參數Table 3 Genetic diversity parameters of ten microsatellite loci

2.7 綿羊肉基因組SSR引物特異性檢測分析

通過對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊所檢測的50個基因組SSR標記位點峰圖進行分析，發現其中3 對引物能夠顯著區分3種綿羊品種。圖6～8分別為scaffold632:150-463、scaffold31384:146-461和scaffold7676:103-270對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的毛細管電泳圖結果。

根據SSR分型峰圖，分別建立了寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的SSR標準分型峰值譜圖。由圖6可知，scaffold632:150-463引物對灘羊的特征值大小為207.96 bp和210.28 bp，對新疆細毛羊和藏綿羊特征值大小分別是215.17 bp和215.24 bp，表明scaffold632:150-463熒光引物對寧夏灘羊源性肉特異性良好，可以對寧夏灘羊與新疆細毛羊和藏綿羊進行區分。由圖7可知，scaffold31384:146-461引物對新疆細毛羊的特征值大小為228.37 bp和231.45 bp，對寧夏灘羊和藏綿羊特征值大小分別是230.39 bp和230.41 bp，表明scaffold31384:146-461熒光引物對新疆細毛羊源性肉特異性良好，能夠對新疆細毛羊與寧夏灘羊和藏綿羊進行區分。由圖8可知，scaffold7676:103-270引物對藏綿羊的特征值大小為94.83 bp和110.46 bp，對寧夏灘羊和新疆細毛羊特征值大小分別是111.46 bp和111.45 bp，表明scaffold7676:103-270熒光引物對藏綿羊肉特異性良好，能夠對藏綿羊與新疆細毛羊和寧夏灘羊進行區分。

圖6 綿羊基因組scaffold632:150-463位點SSR電泳圖Fig. 6 Capillary electrophoregrams of ovine genome with primer scaffold632:150-463 genomic

圖7 綿羊基因組scaffold31384:146-461位點SSR電泳圖Fig. 7 Capillary electrophoregrams of ovine genome with primer scaffold31384:146-461

圖8 綿羊基因組scaffold7676:103-270位點SSR電泳圖Fig. 8 Capillary electrophoregrams of ovine genome with primer scaffold7676:103-270

2.8 特異性引物的有效性與適用性檢驗結果

2.8.1 DNA提取質量評估

分別對提取得到的3種綿羊肝臟DNA和肌肉DNA進行質量評估，結果見表4。樣本所提取肌肉DNA質量濃度為（125.6±0.02）ng/μL，總體積50 μL，樣本A260nm/A280nm為1.80±0.04；樣本所提取肝臟DNA質量濃度為（128.9±0.01）ng/μL，總體積50 μL，樣本A260nm/A280nm為1.82±0.03。表明DNA未被蛋白或酚類物質污染。圖9為DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，顯示樣本主條帶清晰，表明DNA完整性好，DNA分子無降解。由實驗結果可知，3種綿羊的肝臟DNA和肌肉DNA的提取質量相差不大，且相同體積下，肝臟DNA的質量濃度更高。一般來說，脊椎動物的肌肉、心臟、肝、腎、脾等器官組織都是DNA的良好來源，但肝臟的DNA產量最大。動物DNA的提取多以肝臟為原料，這是由于肝臟是可以不斷產生新細胞的器官，很多細胞處在分裂期，此時DNA呈現高度螺旋狀態，通過微量采樣就可以提取得到大量DNA，能夠滿足各種涉及PCR的分子生物學實驗[36]。李龍飛等[37]通過采集雞的肝臟、血液、羽髓等不同部位樣品，采用不同處理程序提取樣品基因組DNA。結果表明，雞肝臟（50 mg）樣品的基因組DNA提取量與雞微量血液（50 μL）和羽髓樣品的基因組DNA提取量相當。蔡振媛等[38]為確定一種方便的野外動物樣品保存方法，用不同方法處理高原鼠肌肉和肝臟組織，并提取基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計對提取的基因組總DNA質量進行檢測，結果顯示：通過相同方式處理并提取的肝臟DNA產量比肌肉組織高，說明肝臟是理想的基因組DNA提取樣本。

表4 DNA質量結果Table 4 Results of DNA quality

圖9 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig. 9 Electrophoresis profile of DNA

2.8.2 3 條特異性引物的毛細管電泳檢測結果

將提取的寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細毛羊的肝臟和肌肉DNA，采用3 條熒光引物分別擴增后，進行毛細管電泳檢測，檢測結果見表5。引物scaffold632:150-463的毛細管電泳檢測結果表明，Liver 1～5、Muscle 1～5，共5 只綿羊為寧夏灘羊；引物scaffold31384:146-461的毛細管電泳檢測結果顯示，Liver 6～10、Muscle 6～10，共5 只綿羊為新疆細毛羊；引物scaffold7676:103-270的毛細管電泳檢測結果顯示，Liver 11～15、Muscle 11～15，共5 只綿羊為藏綿羊。說明通過SSR方法獲得的3 條熒光引物對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的肌肉和肝臟特異性和適用性均良好，能夠對這3種綿羊肉進行有效區分。

表5 特異性引物驗證結果Table 5 Verification of specific primers

3 結 論

本實驗提取純種寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的肝臟DNA，DNA提取結果表明DNA無污染且完整性好。利用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進行文庫構建、擴增、純化和質控，結果表明文庫堿基質量良好，隨機性較好，堿基組成分布比較均勻，實現綿羊全基因組成功建庫。通過50 對SSR引物進行PCR擴增并使用毛細管電泳檢測SSR分型后，挑選多態性引物對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊樣本進行遺傳多態性檢測。結果顯示，有10 對SSR引物成功擴增出穩定條帶，具有豐富又穩定的多態性。將10 對多態性SSR引物對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊進行遺傳多樣性分析。其中，寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的平均Na分別為4.100、3.100和3.600；平均Ne分別為3.782、2.747和3.193；平均Ho分別為1.007、1.009和0.953；平均He分別為0.704、0.615和0.660；平均PIC分別為0.432、0.414和0.425，說明寧夏灘羊的遺傳多態程度要高于藏綿羊和新疆細毛羊。毛細管熒光電泳檢測峰圖結果表明：scaffold632:150-463熒光引物對寧夏灘羊源性肉特異性良好，scaffold31384:146-461熒光引物對新疆細毛羊源性肉特異性良好，scaffold7676:103-270熒光引物對藏綿羊肉特異性良好；這3 對引物能夠實現對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的有效區分，且對于不同品種的羊肉檢測有很好的適用性。此研究成功建立我國西北地區3個綿羊品種的基因庫，科學準確鑒別3個品種純種綿羊肉，不僅進一步擴大了寧夏純種灘羊的鑒別范圍，保證寧夏純種灘羊的優勢，而且對于西部地區綿羊肉產業發展以及科學開發利用也具有重要的指導意義。