指狀青霉DSM62840生物轉化檸檬烯生產α-松油醇過程中關鍵酶的分離純化及質譜鑒定

張璐璐，范 剛*，李 曉，任婧楠，潘思軼，黃 文，何 進

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室， 湖北 武漢 430070；3.華中農業大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430070）

指狀青霉（Penicillium digitatum）不僅是導致柑橘類水果發生綠霉病的主要真菌[1]，同時也是一種具有廣闊應用前景的微生物資源，能夠將價廉而豐富的原材料轉化生成更有經濟價值的產物。其中，指狀青霉DSM62840具有轉化單萜類化合物檸檬烯的能力，能夠將檸檬烯轉化生成香氣更濃、應用更為廣泛、商業價值更高的香料α-松油醇[2-4]。

近些年來，有關檸檬烯生物轉化生產α-松油醇的研究已經取得了不少有意義的成果，主要集中在菌種的篩選[5-8]、轉化條件的優化[9-11]及影響轉化的原因等方面[4,12]。 但是由于在轉化過程中底物對微生物的抑制作用以及產物的分離問題，使得檸檬烯生物轉化的工業應用仍然受到一定的限制。其中分離純化酶制劑成為一個有效的方法，不僅可以解決以上這些問題，還可以提高反應的生物轉化率和立體選擇性，最大限度地減少產物異構體和對映體的產生[13]。然而，目前對檸檬烯微生物轉化生產α-松油醇過程中關鍵酶的研究還不夠深入，仍然停留在推測階段，相關的研究還非常少。因此，涉及在檸檬烯生物轉化生產α-松油醇過程中的關鍵酶仍然不清楚。

本實驗室前期對檸檬烯轉化過程中關鍵酶的性質進行了初步研究，結果表明CYP450抑制劑（SKF-525A）和金屬蛋白酶抑制劑（鄰二氮菲）能夠明顯抑制檸檬烯的微生物轉化過程[14]，并且檸檬烯誘導處理能夠顯著增加該酶的活性，說明檸檬烯轉化過程中的關鍵酶可 誘導[4,15]。此外還通過離心沉淀法分離各亞細胞組分，進行了酶的定位實驗，研究結果表明該酶存在于微粒體中，并且添加去垢劑能夠促進酶的溶解和增強酶的活性[14]。因此，在前期研究基礎上，本實驗以指狀青霉DSM62840為研究對象，通過超速離心獲得微粒體部分，采用硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析、凝膠過濾層析和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法，對指狀青霉DSM62840生物轉化檸檬烯生成α-松油醇過程中的關鍵酶進行分離純化和鑒定，旨在為α-松油醇類香料的合成提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指狀青霉DSM62840購自德國微生物菌種保藏中心；指狀青霉DSM62840液體培養基麥芽酵母肉湯（malt yeast broth，MYB）：酵母提取物3 g/L，麥芽提取物20 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L。

R-(+)-檸檬烯 東京化工有限公司；R-(+)-α-松油醇 美國Sigma公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 上海麥克林生化科技有限公司； 40%丙烯酰胺、四甲基乙二胺（N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine，TEMED） 北京莊盟國際生物基因科技有限公司；十二烷基-β-D-麥芽糖苷（n-dodecyl-β-D-maltoside，DDM） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；CHTTMCeramic羥基磷灰石（type I，20 μm） 美國Bio-Rad公司；SuperdexTM20010/300 GL 美國GE Healthcare公司；Q5 High-Fidelity DNA聚合酶 美國NEB 公司。

1.2 儀器與設備

TripleTOF 5600 LC-MS/MS聯用儀 美國SCIEX公司；凝膠成像系統（Gel Doc XR） 美國Bio-Rad 公司；AKTA pure L蛋白多糖分離純化儀 美國GE醫療集團；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；高壓細胞破碎儀 廣州聚能納米生物科技股份有限公司；超速離心機 美國Beckman公司；6890N-5975B氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的獲得

參照Zhang Lulu等[14]的方法。用1～2 周的指狀青霉DSM62840斜面培養物制取孢子懸浮液，調整孢子懸浮液的濃度為1.5×107spores/mL。取1 mL孢子懸浮液接種于100 mL MYB培養基中，24 ℃、150 r/min振蕩培養48 h，真空抽濾得到菌體。用Buffer 1（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，含1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L EDTA）重新懸浮，然后再抽濾去除培養基成分，重復2 次。將洗滌好的菌體重新懸浮于Buffer 1中，約10 g菌體（濕質量）溶解在100 mL的緩沖液中。在經過高速分散器處理之后，4 ℃高壓細胞破碎儀破碎細胞，次數為5 次，壓力為1 500 bar[16]。10 000×g離心20 min得到橙黃色的上清液，上清液再次重復離心得到F1組分，即去除線粒體的上清液。隨后，將獲得的F1溶液經40 000×g離心90 min，去除上清液，沉淀則溶解在緩沖液Buffer 2（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，含1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L EDTA、0.8% DDM）中，低速攪拌1 h之后，10 000×g離心40 min，上清液即為粗酶液。

1.3.2 硫酸銨沉淀

參照Mehta等[17]的方法。在粗酶液中，緩慢加入固體硫酸銨，使其飽和度為30%，充分攪拌之后，于4 ℃靜置3 h。10 000×g離心30 min，分別收集上清液和0%～30%的沉淀。然后在上清液中繼續添加固體硫酸銨，使其飽和度達到60%，充分攪拌之后，4 ℃靜置3 h。10 000×g離心30 min，分別收集上清液和30%～60%的沉淀。然后在上清液中繼續添加固體硫酸銨，使其飽和度達到90%，充分攪拌之后，4 ℃靜置3 h。10 000×g離心30 min，收集60%～90%的沉淀。將收集的硫酸銨飽和度為0%～30%、30%～60%和60%～90%的沉淀充分復溶于Buffer 2中，然后離心收集上清液，測定收集的每部分上清液中的酶活力。

將硫酸銨沉淀獲得的上清液裝入透析袋中，于4 ℃透析12 h除去硫酸銨，透析液使用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000濃縮后備用。

1.3.3 羥基磷灰石層析

將柱材料懸浮于3.5 倍體積的裝柱緩沖液（200 mmol/L的磷酸鹽）中，靜置，使封閉于填料顆粒中的空氣分離出來。先將裝柱緩沖液灌入層析柱中大約1～2 cm，然后將處理好的柱材料緩慢的裝入層析柱中，打開出口，重力下流，直至高度恒定，關閉層析柱出口。與AKTA蛋白純化儀連接，用3 倍柱體積的裝柱緩沖液平衡洗脫后備用。

用5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）洗脫平衡至UV和cond不變，取一定量經過透析濃縮后的酶溶液上樣，然后分別用5、200 mmol/L和500 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（緩沖液中均含有0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫3個柱體積，流速為1 mL/min，分管收集，每1.5 min收集1 管。測定收集的每管洗脫液中的酶活力，濃縮后備用。

在純化結束之后，柱子用500 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗3～5個柱體積進行再生處理，最后保存在0.1 mol/L NaOH溶液中。

1.3.4 凝膠過濾層析

使用SuperdexTM200 10/300 GL預裝柱進行蛋白分離純化。將層析柱連接AKTA蛋白純化儀之后，用20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）洗脫平衡至UV和cond不變，取一定量經過透析濃縮后的酶溶液上樣，采用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）洗脫，洗脫流速為0.5 mL/min，分管收集，每管1 mL。測定收集的每管洗脫液中的酶活力，濃縮后備用。

1.3.5 檸檬烯生物轉化生產α-松油醇過程中關鍵酶活力的測定

參照Zhang Lulu等[14]的方法。取1 mL蛋白溶液與840 mg/L檸檬烯溶液于2 mL離心管中混合均勻，24 ℃、150 r/min反應12 h，然后立即取出置于4 ℃終止反應。采用固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）-GCMS測定關鍵酶活力。實驗重復3 次。

SPME-GC-MS測定：取反應液裝入30 mL萃取瓶中，于磁力攪拌器40 ℃加熱平衡15 min后，插入己活化好的50/30 pmDVB/CAR/PDMS的SPME萃取頭（250 ℃活化15 min），推出纖維頭，頂空吸附40 min后，插入GC-MS進樣口解吸5 min。

GC條件：毛細管柱為HP-5（30 m×320 μm，0.25 μm），程序升溫，起始溫度40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至220 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃，氫火焰離子檢測器溫度250 ℃。

MS條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子化方式為電子電離，電子能量70 eV，質量范圍為45～550 u/s。

使用計算機譜（NIST05/WILE7.0）和α-松油醇標品進行定性分析。采用外標法對α-松油醇的含量進行定量，標準曲線為y=131 423x+2×106（R2=0.999），其中x為α-松油醇質量濃度（mg/L），y為峰面積。

酶活力單位定義：在上述反應條件下，每小時產 生1 mg/Lα-松油醇定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參照Laemmli等[18]的方法，采用12%分離膠與5%濃縮膠進行蛋白的SDS-PAGE分析，上樣量為30 μL，恒壓100 V進行電泳，當指示劑到達距前沿1 cm時，終止電泳。電泳結束后，染色液過夜染色，然后脫色液進行脫色，每隔3 h換一次脫色液，直到蛋白條帶清晰為止。

1.3.7 LC-MS/MS分析

1.3.7.1 樣品處理

挖取SDS-PAGE中蛋白所在的區域，切成1 mm3左右的小塊；加入超純水浸沒膠塊，振蕩10 min后，吸去洗液；用50%乙腈-100 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）溶液將膠塊浸沒，振蕩10 min，吸去洗液，重復該過程共3 次；加入100%乙腈浸沒膠塊，振蕩10 min，吸去洗液，然后把膠塊在真空抽干儀中抽干；向膠塊中加入10 mmol/L DTT-50 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）溶液，56 ℃孵育1 h進行還原反應，之后吸去浸液；隨后加入55 mmol/L碘乙酰胺-50 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）溶液，置于室溫、暗處反應30 min，之后吸去浸液；加入100%乙腈，振蕩20 min，吸去浸液，抽干膠塊；向膠塊中加入適量的胰蛋白酶，并補加50 mmol/L NH4HCO3溶液以完全覆蓋膠塊，37 ℃孵育過夜進行酶切；然后加入抽提液60%乙腈-5%甲酸，超聲波振蕩10 min，離心后吸取上清液至新的離心管；重復抽提過程2 次后，合并抽提液，在離心濃縮儀中抽干；使用C18小柱進行肽段除鹽，凍存于-20 ℃等待上機檢測。

1.3.7.2 MS檢測

使用SCIEX公司的TripleTOF 5600 LC-MS/MS聯用系統進行[19]。肽段樣品通過自動進樣器吸入后結合至C18捕獲柱（5 mm×0.3 mm，5 μm），接著被洗脫至分析柱（75 μm×150 mm，3 μm，100 ?）進行分離。利用2個流動相（流動相A：0.1%甲酸溶液；流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液）建立30 min的分析梯度（0～15 min，95%～65% A、5%～35% B；15～16 min，65%～20% A、 35%～80% B；16～21 min，20% A、80% B；21～21.1 min，20%～95% A、80%～5% B；21.1～30 min，95% A、5% B）。LC流速設置為 300 nL/min。MS IDA模式分析時，每個掃描循環中包含一個MS全掃描（m/z350～1 500，離子累積時間250 ms），以及隨后的40個MS/MS掃描 （m/z100～1 500，離子累積時間50 ms）。MS/MS采集的條件設置為母離子信號大于120 cps，電荷數為+2～+5。 離子重復采集的排除時間設置為18 s。

1.3.7.3 數據庫檢索

TripleTOF 5600產生的MS數據通過ProteinPilot（V4.5）進行檢索，采用的數據庫檢索算法是Paragon[20-21]。檢索使用的數據庫是UniProt中Penicillium digitatum的蛋白質組參考數據庫。檢索參數如下：Sample Type選Identification；Cys Alkylation選Iodoacetamide；Digestion選Trypsin；Search Effort設置為Rapid ID。檢索結果以Unused≥1.3為標準進行篩選，刪去反庫中檢索的條目和污染蛋白，余下的鑒定信息用作后續分析[19]。

1.4 數據處理

所有實驗均至少重復3 次以上，采用SPSS 16.0進行數據分析、Origin 8.5進行繪圖，數據以±s表示。

2 結果與分析

2.1 硫酸銨沉淀

菌體經過高壓破碎、超速離心之后，獲得的微粒體部分，即為粗酶液。將粗酶液進行硫酸銨沉淀，如圖1所示，在硫酸銨飽和度為0%～30%時，收集到的沉淀很少，復溶之后，檢測不到酶活力。在硫酸銨飽和度為30%～60%時，有大量的蛋白被沉淀，并且將沉淀復溶之后，酶活力為442.73 U/mL。在硫酸銨飽和度為60%～90%時，也有大量的蛋白被沉淀，但將沉淀復溶之后，檢測不到酶活力。因此，選擇硫酸銨的飽和度為30%～60%進行蛋白的富集。將所得到的蛋白沉淀進行復溶，離心，取上清液，透析濃縮后用于羥基磷灰石層析。

圖1 硫酸銨沉淀曲線Fig. 1 Ammonium sulfate precipitation curves

2.2 羥基磷灰石層析

如圖2所示，共有2個蛋白洗脫峰被檢出，其中第1個蛋白洗脫峰沒有檢測到酶活力，而第2個蛋白洗脫峰有較高的酶活力，說明第2個洗脫峰中含有轉化檸檬烯生成α-松油醇的關鍵酶，因此收集對應的餾分用于凝膠過濾層析。

圖2 羥基磷灰石純化曲線Fig. 2 Elutions curves of hydroxyapatite chromatography

2.3 凝膠過濾層析

如圖3所示，在洗脫液中共檢測到3個蛋白洗脫峰，其中第1個蛋白洗脫峰有較高的酶活力，可以轉化檸檬烯生成α-松油醇，說明檸檬烯轉化的關鍵酶是存在于這部分洗脫液中。因此，收集該部分餾分做進一步分析。

圖3 凝膠過濾純化曲線Fig. 3 Elution curves of gel filtration chromatography

2.4 SDS-PAGE分析

將通過上述一系列純化步驟收集到的洗脫液和標準蛋白質經過電泳、染色、脫色等處理之后，得到SDSPAGE譜圖，結果見圖4。在泳道6中存在1 條明顯的蛋白條帶，分子質量在45～60 kDa之間，并且該條帶在泳道2～5中也比較明顯，因此推測該條帶中蛋白可能參與調控檸檬烯的微生物轉化過程。

圖4 純化蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE profile of purified proteins

2.5 LC-MS/MS分析

為了進一步確定圖4泳道6中的蛋白，將泳道6中箭頭所指處的條帶挖出，通過LC-MS/MS檢測樣品中的蛋白質組成。將樣品中提取的蛋白質經過還原、烷基化、酶解變為肽段混合物，然后再經過電噴霧進入MS進行掃描，得到MS譜圖，最后通過相關的軟件解析這些MS圖得到樣品中蛋白質的定性或定量信息。

2.5.1 質量控制

如圖5A所示，橫坐標表示各鑒定肽段質量偏差，即MS檢測質量與肽段理論質量的偏差。縱坐標表示各條形區間內肽段總數目。結果表明各肽段質量偏差都在2×10-5以內，說明MS檢測精度良好。

圖5 質量控制分析Fig. 5 Analysis of quality control

本實驗所用儀器檢測m/z范圍為350～1 350。肽段離子化后大部分電荷數為2或3。各鑒定肽段長度如圖5B所示，大部分肽段長度分布在8～20個氨基酸殘基之間，符合胰蛋白酶酶切規律，有利于MS檢測。

各肽段漏切位點如圖5C所示，結果表明大部分肽段無漏切位點，少量肽段有1個或2個漏切位點，表明酶切充分，樣品制備達標。

2.5.2 數據總覽

通過MS鑒定和分析，從泳道6中的條帶共鑒定得到87個蛋白。基于蛋白豐度越高，采集的譜圖數越多的經驗，可以根據譜圖數的多少大致反映蛋白在樣品中豐度高低。因此，選擇譜圖數前10的蛋白，如表1 所示。在該條帶中，蛋白豐度最高的蛋白被鑒定為PDIDSM_08010（二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD），EC 1.8.1.4），分子質量為54.36 kDa，該蛋白對應的二級MS圖數有204個。結合SDS-PAGE膠上條帶顯示的蛋白，推測該條帶中的蛋白可能為DLD。

表1 MS鑒定結果Table 1 Results of LC-MS/MS identification

結合實驗室前期的轉錄組數據和蛋白組學數據，進一步分析DLD在檸檬烯轉化過程中mRNA的表達量和蛋白的表達量（指狀青霉DSM62840轉錄組數據已經被上傳至NCBI’s Sequence Read Archive，收錄號為PRJNA608617；指狀青霉DSM62840蛋白質組數據已經被上傳至iProX數據庫，收錄號為PXD017752），結果如表2所示。DLD在轉錄水平上的表達量略微下調，在蛋白水平上的表達量略微上調。DLD屬于pyridine nucleotide disulfide oxdoreductase family，該家族還包括谷胱甘肽還原酶、汞還原酶、硫氧還蛋白以及錐蟲胱甘肽還 原酶[22]。DLD通常是以二聚體的形式存在的，每個亞基上都帶有一個活性的二硫鍵和一個非共價結合的黃素輔基。DLD是一種NAD+依賴的氧化還原酶，能夠催化二氫脂酰部分發生氧化反應。它是丙酮酸脫氫酶復合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）和α-酮戊二酸脫氫酶復合物（ketoglutarate dehydrogenase complex，KGDC）的亞基，PDC和KGDC在生物的能量代謝途徑中起非常重要的催化作用。PDC作為代謝的看門人，決定葡萄糖的命運，而KGDC是電子傳遞鏈和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環的主要介體，在代謝過程中起主要作用[23]。此外，DLD也是甘氨酸裂解系統的一部分，具有黃遞酶活性。

3 討 論

近些年來，有關檸檬烯生物轉化生產α-松油醇的研究已經取得了不少有意義的成果，但是有關轉化過程中關鍵酶分離純化的研究還鮮見報道。其中，利用傳統的蛋白分離純化技術獲得與檸檬烯轉化相關的蛋白是一種最常用的方法。研究指出，在紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolisDCL14）中不僅存在檸檬烯C1,2位環氧化反應，也存在C6位羥基化反應。研究人員利用凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析以及離子交換層析，先后從該菌株中分離純化得到檸檬烯-1,2-環氧化物酶和香芹醇脫氫酶，分別能夠轉化檸檬烯生成檸檬烯-1,2-環氧化物和羥基化香芹醇生成香芹酮[24-25]。Van Beilen等[26]通過硫酸銨沉淀、疏水相互作用層析和離子交換層析等方法從分枝桿菌（Mycobacteriumsp.strain HXN-1500）中分離得到CYP153A6，該蛋白能夠催化檸檬烯生成紫蘇醇。Cadwallader等[27]通過蔗糖梯度離心和凝膠柱層析相結合的方法從唐菖蒲假單胞菌（Pseudomonas gladioli）中分離純化得到α-松油醇脫氫酶，該酶可以將檸檬烯轉化生成α-松油醇，但研究人員并沒有對該酶進行測序分析和MS鑒定。在本研究的前期工作中，嘗試了各種純化方法對微生物轉化過程中的關鍵酶進行分離純化，如蔗糖梯度離心、PEG沉淀、DEAE-Sepharose FF以及疏水相互作用層析等。其中DEAE-Sepharose FF和疏水相互作用層析均不能有效對檸檬烯轉化過程中的關鍵酶進行分離純化，而蔗糖梯度離心雖然能夠對轉化過程中的蛋白進行一定程度的分離純化，但純化效果不佳。在40 000×g離心8 h之后，蔗糖質量濃度分別為50、45、40、35 g/100 mL和30 g/100 mL的溶液中，均能夠檢測到酶活力（數據未展示）。此外，還使用0%～7%、7%～15%、15%～20% PEG進行分級沉淀，結果顯示7%～15% PEG能夠有效對微生物轉化過程中的關鍵酶進行富集（數據未展示），但考慮到后續去除PEG的問題，最終選擇了硫酸銨進行初步的分離。

在實驗過程中，首先通過高壓破碎細胞，然后超速離心獲得微粒體部分，最后采用30%～60%的硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析和凝膠過濾層析對轉化過程中的關鍵酶進行分離純化。對各部分的流出液進行SDS-PAGE分析，結果顯示在分子質量約為50 kDa處有一條明顯的蛋白條帶。隨后，對該條帶進行LC-MS/MS分析，得出該條帶中的蛋白可能是DLD。推測DLD可能參與調控檸檬烯的微生物轉化，但在該轉化過程中，可能還有其他蛋白的參與。研究指出，在檸檬烯轉化生成α-松油醇的過程中，檸檬烯可能先發生環氧化生成檸檬烯-8,9-環氧化物，然后環裂解生成α-松油醇[28]。這說明在檸檬烯轉化的過程中，可能不止一個蛋白參與，很有可能是多個酶共同作用的結果。

DLD能夠以NAD+為輔基接受質子和電子。DLD是PDC和KGDC產生線粒體活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的主要來源。在不同脅迫條件下，DLD可能誘導或減弱ROS的產生。DLD不僅參與TCA循環中的能量代謝，還與線粒體中ROS的生成和清除有關[29]。在本課題組之前的研究也發現，微生物轉化過程中，檸檬烯處理可能會誘導指狀青霉DSM62840發生嚴重的膜脂過氧化損傷，產生過量ROS，破壞細胞膜結構，改變細胞膜的流動性和通透性，降低ATP含量，從而抑制TCA循環和指狀青霉DSM62840菌絲體的生長[14,30]。此外，轉錄組數據結果顯示，在檸檬烯轉化的過程中，DLD表達量下降。研究發現降低DLD的表達能夠增加ROS的產生，降低線粒體膜電位，增加NAD+/NADH比值，減少TCA循環中間產物的產生，從而導致TCA循環異常和造成線粒體氧化損傷[31]。并且Midzak等[32]研究發現DLD能夠通過調控細胞內的ATP、ROS、第2信使cAMP、鈣離子水平來調節類固醇激素的合成。因此，推測DLD可能通過調控細胞內的ATP含量、ROS等調節檸檬烯的微生物轉化過程。未來需要對DLD的功能進行進一步的研究。

4 結 論

以指狀青霉DSM62840為研究對象，首先通過高壓破碎細胞，然后超速離心獲得微粒體部分，最后通過30%～60%的硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析和凝膠過濾層析對指狀青霉DSM62840轉化檸檬烯生產α-松油醇過程中的關鍵酶進行分離純化。SDS-PAGE結果顯示在分子質量約為50 kDa處有1 條明顯的蛋白條帶。通過LC-MS/MS鑒定，該蛋白可能是DLD，推測其可能參與調控檸檬烯生物轉化生產α-松油醇的過程。