馬氏珍珠貝肉蛋白水解特征及其ACE抑制肽的篩選

李 姣，蘇繼磊，陳 敏，尹 浩

（1.中國科學院南海海洋研究所，中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，廣東 廣州 510301；2.中國科學院大學地球與行星科學學院，北京 100049）

高血壓是各種心腦血管疾病發生發展的主要病因之一，預計到2025年，發病人數將超過15億[1]。在高血壓的發病機理中，血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）起著至關重要的作用，它一方面可以催化血管緊張素I轉化為血管緊張素II，另一方面它還促進緩激肽的降解，這兩個行為均會引起血壓的升高[2-4]。因此，抑制ACE是目前臨床上治療高血壓的有效方法。現階段常用的ACE抑制劑包括卡托普利、依那普利和貝那普利等。然而，這些化學合成的藥物通常表現出一些顯而易見的不良作用[5-7]。根據最近的文獻報道，某些食品諸如大豆、牛奶、魚蝦貝類的肉中含有豐富的蛋白質，它們的蛋白水解物呈現出一定生物活性，如抗氧化、降壓、抗菌及降血糖等[8-12]。因此大量研究開始致力于從天然無毒的食品蛋白水解物中開發用于治療高血壓的活性肽，而對蛋白水解物的水解特征及起活性作用的關鍵結構進行研究是開發高價值活性肽最重要的一步。

馬氏珍珠貝（Pinctada fucata）是我國南方沿海地帶用作珍珠培育的經濟貝類，然而，珍珠貝經采珠后，其貝肉大多僅具有食用價值。因此，使用蛋白酶對貝肉進行酶解，開發珍珠貝肉的附加價值，是實現珍珠貝蛋白資源高效利用的關鍵步驟。目前，對珍珠貝蛋白的酶解多集中在抗氧化、ACE抑制、促進創傷愈合等活性的研究[13-16]。其研究思路大多以活性為追蹤目標，利用傳統的分離純化方法鑒定出活性肽，方法繁瑣復雜，費時耗力，且純化出的活性肽可能是由某幾個肽組成的共洗脫組分，對于單個活性肽的鑒定依然很困難，并且鑒定出的肽的特征及活性機理仍不可知。

近年來，隨著生物信息學的發展，大量具有預測肽序列及其理化特征的數據庫應運而生，給多肽的初步篩選提供了極大的便捷。并且，計算機輔助藥物篩選技術的更新對多肽篩選及大分子和小分子之間相互作用機制的研究也起到了推動作用。BIOPEP、PeptideCutter等各大網站被用于預測從特定蛋白質中釋放出來的活性肽序列[17-21]，然而，這些網站采用的是虛擬酶解法，其釋放出的肽段可能在真實酶解中并不存在，因為真實酶解釋放出的活性肽序列受蛋白質的空間結構、酶解溫度及pH值等各種條件的影響。Fu等[22]采用虛擬酶解與體外真實酶解相結合研究了膠原蛋白α-1(I)和α-2(I)的酶解情況，發現胃蛋白酶酶解產物中經鑒定有序列為Gly-Pro-Arg-Gly-Phe的ACE抑制肽，然而，其在虛擬酶解中并未被發現，這主要是因為虛擬酶解中預測的肽是理論上釋放的肽序列，而真實酶解則受多種外部條件的影響。因此，只有將酶解活性實驗與以計算機為輔助的篩選相結合，才能高效地篩選出高活性的目標肽段。

本研究采用超濾及凝膠色譜Sephadex G-25對馬氏珍珠貝肉酶解物進行初步分離，獲得相對高活性的ACE抑制組分F2和F3。本實驗目的在于研究馬氏珍珠貝肉在不同酶解時間下的分子質量變化，以及隨著酶解時間一些特征峰的變化，并對F2、F3組分進行鑒定，從而解析酶解物中活性肽的結構特征，最后采用分子對接的方法篩選其中潛在的ACE抑制肽，對其抑制機理進行初探，以期為珍珠貝來源活性肽應用于降血壓功能性食品和藥品開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠貝肉購于湛江海鮮市場，解凍后使用研磨機磨碎，采用貝肉-異丙醇1∶4（g/mL）脫脂3 h后，將其晾在空氣中干燥并貯存在-20 ℃以備用。

堿性蛋白酶（200 000 U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸（hippuryl-histidylleucine，HHL）、ACE（來自兔肺） 美國Sigma 公司；截留分子質量為3 kDa的超濾管 美國Millipore 公司；合成肽（純度＞98%） 吉爾生化（上海）有限公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

DK-8D數顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司； 5810R臺式高速大容量離心機 德國艾本得公司；冷凍干燥機 德國Christ公司；電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；1260分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；Impact X高分辨四極桿飛行時間串聯質譜 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解物的制備

稱取一定量脫脂后的珍珠貝肉干，加入堿性蛋白酶酶解，溫度50 ℃，pH 10.0，底物質量分數8%，酶-底物比8 000 U/g，酶解時間分別為2、4、6、8、10 h。酶解結束后將酶解產物放入沸水15 min滅酶活，接著8 000×g離心20 min，得上清液，過0.45 μm濾膜，即得珍珠貝肉酶解物，凍干，存放在-20 ℃下備用。

1.3.2 酶解物的Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

分別配制18%分離膠及5%濃縮膠，灌膠后等待膠凝固。將不同酶解時間的酶解物溶于水中，配制成 100 mg/mL多肽溶液。吸取多肽溶液20 μL，加入同等體積上樣緩沖液，煮沸6 min，離心3 min，分別吸取20 μL多肽與上樣緩沖液的混合溶液到膠孔中，以60 V電壓將混合液在濃縮膠中壓縮成一條線后，再以100 V電壓跑分離膠。電泳完畢后加入固定液固定條帶30 min，加入考馬斯亮藍R250染色1 h，隨后脫色至背景顏色完全褪去。

1.3.3 酶解物的分子質量分布測定

配制1 mg/mL的標準品（細胞色素C、胰島素、抑肽酶、VB12、N-HHL水合物），上樣10 μL，經Agilent Bio SEC-5柱等度洗脫，洗脫液為0.5 mol/L磷酸緩沖液（含2 mol/L NaCl），流速0.5 mL/min，繪制出標準品與洗脫時間之間的標準曲線。同時，將樣品配制成10 mg/mL，上樣到HPLC系統中，在與標準品同樣的條件下洗脫，對照標準曲線，計算出樣品的分子質量分布。

1.3.4 酶解物在反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）上的洗脫

將不同水解時間的酶解物上樣到RP-HPLC中，觀察不同酶解時間樣品的洗脫情況，進樣20 μL，流速為1 mL/min，流動相A為0.1%三氟乙酸溶液，B為甲醇（色譜純），洗脫程序為：0～5 min，99% A、1% B；5～35 min，99%～39% A、1%～61% B；35～38 min，39%～0% A、61%～100% B；38～46 min，0% A、100% B；46～48 min，0%～99% A、100%～1% B；48～56 min，99% A、1% B平衡至初始狀態。

1.3.5 酶解物初分離及鑒定

將酶解物經超濾管（截留分子質量為3 kDa）及Sephadex G-25凝膠過濾柱（3.5 cm×30 cm）進行初步分離，活性跟蹤得到2個ACE抑制活性相對較強的組分F2、F3，采用液相色譜-串聯質譜對這兩組分進行質譜鑒定。將F2、F3組分配制成一定質量濃度的溶液（20 μL，10 mg/mL），上樣到安捷倫液相色譜系統中，色譜柱為安捷倫ODS-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），洗脫液A為0.1%甲酸溶液，洗脫液B為甲醇（色譜純），洗脫梯度為：0～5 min，99%A、1% B；5～65 min，99%～39% A、1%～61% B。流速為1.0 mL/min。質譜為電噴霧電離源的maXis Impact MS質譜儀，以正離子模式進行，m/z范圍為200～3 000。其他質譜參數設置如下：干燥溫度180 ℃，電噴霧毛細管電壓4.5 kV，干氣流量4.0 L/ min。本研究采用PEAKS Studio 8.5中的從頭測序法對質譜數據進行解析，母離子和碎片離子分別設置為10-5、0.02 Da，僅保留具有高平均置信度（average local confidence，ALC）值（＞85%）的肽序列。

1.3.6 潛在的ACE抑制肽篩選及合成

為了篩選潛在的ACE抑制肽，使用Autodock vina對鑒定的肽進行分子對接。ACE的晶體結構（編碼：4APH）從PDB網站（http://www.pdb.org）下載獲得。刪除了水和原始配體，并為受體蛋白添加了極性氫原子，隨后該受體由Autodock Tools（版本1.5.6）保存為pdbqt文件。配體小分子結構由ChemOffice 2018生成，也使用Autodock工具打開，并自動添加了Gasteiger電荷，設置旋轉鍵，保存為pdbqt文件。對接時采用文獻[23]方法，搜索空間中心坐標為center_x=12.41，center_y= -4.333，center_z=-18.973，搜索空間大小為size_x=34， size_y=36，size_z=52，對接的結果以結合能值表示，值越低代表小分子與蛋白結合得越緊，其抑制活性越強。使用PyMOL分析具有最低結合能的穩定構象，然后生成3D圖以顯示肽與ACE之間相互作用的最佳構象。另外，使用Discovery Studio Visualizer可視化軟件獲得2D圖。并且，多肽等電點（pI）、凈電荷及水溶性通過多肽特性計算網站獲得（https://pepcalc.com/）[24]。通過比較結合能，篩選活性肽進行固相合成以驗證其活性。

1.3.7 ACE抑制活性的測定

根據Lan等[25]的方法作修改。首先，將實驗所需的所有試劑溶解在硼酸鹽緩沖液（100 mmol/L硼酸鹽，300 mmol/L NaCl，pH 8.3）中，將30 μL 5 mmol/L HHL和10 μL的樣品溶液混合，在37 ℃下預熱6 min。同時，用10 μL硼酸鹽緩沖液代替10 μL樣品溶液制備空白溶液。然后，將30 μL預熱過的ACE溶液（0.1 U）分別加入到空白和樣品溶液中，37 ℃保溫反應30 min，最后通過添加60 μL 0.1 mol/L HCl溶液終止整個反應。馬尿酸的含量通過RP-HPLC測定，用25%乙腈和75% milli-Q水（0.05% TFA）作為流動相進行等度洗脫，流速為 1 mL/min，于228 nm波長處檢測馬尿酸的吸收峰。ACE抑制活性由下式計算：

式中：A1為空白溶液中馬尿酸峰面積；A2為含多肽的樣品液中馬尿酸峰面積。

1.4 統計分析

使用GraphPad Prism 8.0.1繪制圖形，對數據進行單因素方差分析（ANOVA），所有實驗均重復3 次，數據表示為±s，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 珍珠貝肉不同酶解時間樣品的Tricine-SDS-PAGE

如圖1所示，泳道1可以看出珍珠貝肉中的蛋白種類繁多，分子質量多集中在10～35 kDa之間。酶解2 h后大于35 kDa的條帶基本消失，出現了大量小于35 kDa甚至10 kDa左右的條帶。而酶解到第10小時，10～35 kDa之間的條帶也消失，說明酶解產生了大量10 kDa以下的肽，這些分子質量較小的肽難以通過電泳完全跑開。在整個酶解過程中，有一條35 kDa左右的蛋白條帶始終存在，推測它可能是珍珠貝肉中某種或幾種難以被堿性蛋白酶酶解的蛋白。

圖1 珍珠貝肉蛋白水提物及其不同酶解時間酶解物的Tricine-SDS-PAGEFig. 1 Tricine-SDS-PAGE patterns of water-soluble protein extracted from P. fucata meat and its hydrolysates at different hydrolysis times

2.2 珍珠貝肉酶解物的分子質量分布特征

由表1可知，酶解2 h后，蛋白可能只是初步降解，產生的肽段分子質量仍在3 000 Da以上。在酶解時間達到4 h時，產生了大量小于3 000 Da的多肽，占總量的28.39%。在酶解時間為10 h時，產生的低于500 Da小分子肽含量達到最高，為5.82%。隨著酶解時間的進行，大分子蛋白含量逐漸降低，小分子肽含量逐漸升高，這是因為隨著酶解的進行，已產生的長肽鏈，可能再次被蛋白酶切割，導致了更多小分子肽的產生。同時，由于底物的消耗，反應產物的生成，以及酶切位點的有限性，使得新的小分子肽段產生的速率變慢。

表1 不同酶解時間酶解物的分子質量分布Table 1 Molecular mass distribution of hydrolysates at different hydrolysis times

2.3 RP-HPLC對不同酶解時間酶解物的表征

如圖2所示，可以觀察到一個保留時間為20 min左右的特征峰（a），其在2、4、6、8、10 h酶解物樣品中峰面積比分別為3.69%、6.49%、9.23%、10.42%、12.46%。隨著酶解的進行，其相對含量越來越大，特別是從2～4 h之間增加的幅度最大。根據文獻報道[26]，具有ACE抑制活性肽的結構特點是含有大量疏水性氨基酸，這種疏水的特性會使得它們在反相柱上的保留時間相對較長，這與本研究相符，即疏水性的特征峰面積占比隨著酶解時間逐漸增大，說明疏水性的肽含量在逐漸增加，其ACE抑制活性隨著酶解進行可能在逐漸增強。并且，實驗中使用的堿性蛋白酶因具有廣泛的酶切位點，也使得酶解過程中更易產生疏水性的末端氨基酸[5]，含疏水性末端氨基酸的肽隨著酶解進行逐漸累積。

圖2 不同酶解時間酶解物在RP-HPLC上的洗脫Fig. 2 RP-HPLC profiles of hydrolysates at different hydrolysis times

2.4 珍珠貝10 h酶解物活性肽的鑒定、篩選及理化特性

在本研究中，10 h酶解物中小分子肽含量占比最大，并且據報道ACE抑制活性肽大多為小分子肽[27]，因此，在本實驗中選擇10 h的珍珠貝肉蛋白酶解物繼續進行研究。采用超濾及凝膠色譜法對酶解物進行初步的分離及活性跟蹤，經Sephadex G-25柱洗脫后，收集了4個組分（圖3），發現F2和F3組分的ACE抑制活性最強，因此采用液相色譜-串聯質譜對這兩個組分進行鑒定。以PEAKS Studio軟件對質譜數據進行de novo測序，選擇ALC值大于85%的肽段進行分析。接著以Autodock vina軟件對這些肽段進行分子對接，得到的理論結合能如表2所示。同時，通過在線網站對這些肽段的等電點、凈電荷及水溶性進行了預測，發現其等電點范圍在0.67～10.9，凈電荷在-1～1之間，水溶性大部分都不好，說明它們的疏水性強，而疏水性強的肽相對親水肽往往具有更高的生理活性[28]。可以看出PDFF、PPDPAAW、GLQW、FGPW、WFHAVFW、WHAFLW的結合能分別為-10.9、 -10.7、-10.6、-10.8、-10.8、-12.0 kcal/mol，相對其他的肽更低，與ACE結合得更為緊密，其活性可能更高，因此選擇這6個肽進行了固相合成。

圖3 Sephadex G-25的洗脫圖譜Fig. 3 Elution of hydrolysates on Sephadex G-25

表2 F2及F3組分中肽段的鑒定及其他理化特征Table 2 Identification and physicochemical properties of peptides in fractions F2 and F3

續表2

2.5 合成肽的活性驗證及構效關系

取合成肽適量，配制成1 mg/mL的肽溶液，采用1.3.7節方法測定每個樣品的ACE抑制活性，結果如圖4 所示，可知，除了FGPW外，PDFF、PPDPAAW、GLQW、WFHAVFW及WHAFLW均表現出不同程度的ACE抑制活性，特別是肽WFHAVFW及WHAFLW，在 1 mg/mL時，其ACE抑制率分別達到了（95.57±0.37）%及（98.59±0.08）%。因此，肽WHAFLW相比于其他合成肽具有更高的ACE抑制活性，經鑒定，其二級質譜圖如圖5所示。將活性最高的WHAFLW稀釋一系列梯度濃度，測得其IC50值為52.39 μmol/L。因此，該肽可作降壓藥物的先導物以進行后續的研究開發。WFHAVFW及WHAFLW這兩條多肽序列的共同特點是兩端均有疏水性極強的Trp（W），且中間位置均包含帶正電的氨基酸His（H）。推測正是這個特征使得它們具有相對更高的ACE抑制活性。

圖4 合成肽的ACE抑制率Fig. 4 ACE inhibitory rates of synthetic peptides

圖5 六肽WHAFLW的二級質譜信息Fig. 5 MS/MS spectrum of hexapeptide WHAFLW

最近的構效關系表明，分子質量過大或過小的肽均不利于與ACE結合，其ACE抑制活性相對更低，最有潛力的ACE抑制肽由5個或6個氨基酸組成[27]。其次，C端具有疏水性氨基酸（Trp、Leu、IIe等），N端具有芳香族氨基酸（Trp、Tyr等），有利于ACE抑制活性的增加。并且，肽序列中如果含有帶正電的氨基酸（比如Lys、Arg、His），也會增強其抑制ACE的能力，其原因是疏水性的氨基酸容易接近ACE活性口袋中的疏水性殘基，與其形成相互作用。同時，帶正電的氨基酸因為與ACE的C端活性口袋中帶負電的氨基酸（Glu403、Glu162）結合，因此相比于N端，抑制劑更傾向于與C端結合，從而增強了ACE抑制活性。本研究2個高活性肽也是因為兩端含有疏水性兼芳香族氨基酸Trp，中間帶有正電性氨基酸His，從而使得其ACE抑制活性增強。Girgih等[29]報道了四肽WVYY和三肽WYT就是因為C-端氨基酸不同導致了活性差異，四肽WVYY的IC50為27 μmol/L，而WYT的IC50值為547 μmol/L，認為C-端的第3位置疏水性的Val（V），以及C端第1、2位置的2個疏水性Tyr（Y）促進了WVYY中ACE抑制活性的增強，而WYT則由于C端有1個親水性的氨基酸蘇氨酸（T），減弱了其ACE抑制活性，可見C端的疏水性對ACE抑制活性起重要作用。本研究2個高活性肽兩端的Trp（W）也是一種高度疏水的氨基酸，常見的氨基酸疏水順序如下：F＞L=I＞ W=Y＞V＞M＞P＞C＞A＞G＞T＞S＞K＞Q＞N＞H＞E＞ D＞R。Xie Jingli等[30]對一種微藻蛋白進行胃腸道在線模擬消化，從消化的片段中篩選高活性的ACE抑制肽，其篩選的原則之一就是C端氨基酸為芳香族或者環狀氨基酸，比如Trp、Tyr。最終，其篩選到了兩種C端為Trp的高活性ACE抑制三肽TTW和VHW，其IC50值分別為（0.61±0.12）、（0.91±0.31）μmol/L。

2.6 肽與ACE相互作用機理

本研究篩選出的2個最高活性的ACE抑制肽，即七肽WFHAVFW與六肽WHAFLW，與ACE的結合模式如圖6所示。可以看出，肽WFHAVFW（綠色）與WHAFLW（藍色）中結合能最低的構象在ACE中有一部分存在著空間重疊，說明重疊的官能團可能與ACE存在相同的作用，而從2D圖可以看出，兩個肽中這一重疊結構的六元環及五元環中心均與ACE的Phe391形成了Pi-Pi相互作用。

圖6 七肽WFHAVFW、六肽WHAFLW與ACE的分子對接Fig. 6 Molecular docking between peptides and ACE

另外，在抑制劑與酶的作用中，氫鍵也十分重要。氫鍵的數量以及長短影響抑制劑與酶的結合力。在本研究中，2個肽與ACE的殘基均形成了多個氫鍵。七肽WFHAVFW與Ala356、Asn66各形成2個氫鍵，與Asn70、Ser517各形成了1個氫鍵，共6個氫鍵。而六肽WHAFLW與Ala356、Tyr523、Ala354、His513、Gln281、Lys511以及Cys370各形成了1個氫鍵，共7個氫鍵。ACE活性部位主要由3個活性口袋組成，即S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、His513、Lys511和Tyr520）和S1′（Glu162）[30]，可以看出，與六肽WHAFLW形成氫鍵的氨基酸殘基有一部分也屬于這些活性口袋，比如Tyr523、Ala354屬于S1口袋，His513、Gln281、Lys511屬于S2口袋，而與七肽WFHAVFW形成氫鍵的氨基酸殘基均不屬于活性口袋，可見，與活性口袋的氨基酸形成氫鍵對于維持肽-酶復合物穩定性極其重要。因此，六肽WHAFLW的活性在一定程度上高于七肽WFHAVFW。并且，六肽與Zn2+也存在相互作用，有研究報道稱，Zn2+還聯合其他3個氨基酸殘基（Glu411、His383、His 387）一起形成一個可扭轉的四面體結構，對整個復合物的穩定起到了關鍵的 作用[31]。其次，除氫鍵和與金屬離子的相互作用，范德華作用及Pi-Pi作用對復合物的穩定也不可或缺。

3 結 論

馬氏珍珠貝肉蛋白是ACE抑制活性肽產生的重要來源，其酶解特征表明，合適的酶解時間可以定向產生一定分子質量的活性肽。另外，本研究還實現了傳統的酶解實驗與現代計算機輔助篩選技術相結合，高效篩選出了一個高活性的ACE抑制六肽，其氨基酸序列為WHAFLW，體外對ACE抑制的IC50值為52.39 μmol/L，對它的結構分析表明，兩端具有疏水性的Trp（W），中間包含帶正電的His（H），是其具有高ACE抑制活性的重要原因。