QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定薄皮甜瓜中7種葫蘆素

王 琦，岳 寧，李曉慧，李敏潔，蘇 杭，李春梅，王懷松，付秋實(shí)，王 靜，金 芬,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

甜瓜（Cucumis meloL.）是葫蘆科一年生蔓性草本植物，是全球最重要的園藝作物之一。甜瓜以果實(shí)甘甜而著稱，香氣濃郁、風(fēng)味獨(dú)特，含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)素，在我國(guó)果蔬生產(chǎn)和消費(fèi)中占據(jù)重要地位[1-2]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，2018年全球甜瓜面積為104.73萬 hm2，產(chǎn)量達(dá) 2 734.92萬 t，分別占世界水果面積和產(chǎn)量的1.54%及3.15%[3]。中國(guó)作為全球甜瓜最大的生產(chǎn)和消費(fèi)區(qū)，其產(chǎn)量約占世界甜瓜產(chǎn)量的一半（48%）[4-5]。目前，甜瓜已成為我國(guó)帶動(dòng)農(nóng)民增收的高效園藝作物和主要時(shí)令水果，其產(chǎn)業(yè)重要性日益提高[6]。

葫蘆素是甜瓜中苦味物質(zhì)的主要成分之一，是一類高度氧化的四環(huán)三萜化合物[7-8]。葫蘆素在甜瓜的抗蟲、抵抗逆境過程中發(fā)揮了重要作用；同時(shí)還具有抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，具有潛在的藥用價(jià)值。葫蘆素B是甜瓜中葫蘆素的主要成分，其抗腫瘤活性更強(qiáng)[9-12]。現(xiàn)有葫蘆素的檢測(cè)方法多為高效液相色譜法，檢測(cè)種類少、時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、基質(zhì)干擾重，同時(shí)對(duì)甜瓜中其他微量葫蘆素的組成和含量的研究少[13-14]；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高、特異性強(qiáng)，成為目前測(cè)定葫蘆素物質(zhì)的首選檢測(cè)方法。然而，已有的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法更多的關(guān)注葫蘆素B、E等在大鼠血液中的藥代動(dòng)力學(xué)分布，而對(duì)含量較低、活性較高的葫蘆素沒有可用的檢測(cè)方法，缺乏綜合整體評(píng)價(jià)[12,14-19]。

QuEChERS法作為一種簡(jiǎn)便、快速、安全、價(jià)格低廉的分析方法，已成功用于果蔬中農(nóng)藥殘留的分析。近年來該方法在天然有機(jī)物提取及分析中的應(yīng)用越來越多，特別是在活性物質(zhì)的提取和分析，如堅(jiān)果中的生育酚及甾醇、五味子中木脂素成分[20-21]。為更準(zhǔn)確地表征甜瓜中葫蘆素的種類及含量分布，本研究利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合分散固相萃取前處理方法，建立同時(shí)測(cè)定甜瓜中7種主要葫蘆素的檢測(cè)方法，并對(duì)不同成熟期甜瓜中的葫蘆素含量進(jìn)行分析。該方法穩(wěn)定、靈敏度高、分析周期短，可為甜瓜中葫蘆素活性成分的提取及分析提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薄皮甜瓜459由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組提供。

色譜級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品：葫蘆素B（純度＞97%，CAS#6199-67-3），葫蘆素D（純度＞90%，CAS#3877-86-9），葫蘆素E（純度＞95%，CAS#18444-66-1），葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷（純度＞92%，CAS#65247-27-0），葫蘆素IIA（純度＞98%，CAS#58546-34-2），葫蘆素I（純度＞98%，CAS#2222-7-3）和異葫蘆素B（純度＞95%，CAS#17278-28-3） 上海源葉生物技術(shù)有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA，50 μm）、十八烷基鍵合硅膠（C18，50 μm）分散固相萃取吸附劑、乙酸銨（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；氧化鋯包覆硅膠（Z-Sep，50 μm）、碳十八鍵合鋯膠（Z-Sep+，50 μm） 美國(guó)Supelco公司；甲酸（色 譜級(jí)） 美國(guó)Fisher公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 北京化工廠；0.22 μm有機(jī)系濾膜 天津博納艾杰爾公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純；實(shí)驗(yàn)用超純水由 Milli-Q Advantage A10系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexera LC液相系統(tǒng)、LC-MS8060三重四極桿質(zhì)譜（配有電噴霧離子源及LabSolutions數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 日本島津公司；ME104分析天平 瑞士Mettler Toledo 公司；Vortex-Genie 2渦旋混勻器 美國(guó)Scientific Industries公司；Sorvall ST8R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；Milli-Q超純水器 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）配制：準(zhǔn)確稱取7種葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg，用甲醇分別溶解定容至10.0 mL，于-18 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液（10 μg/mL）配制：分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL混合，用甲醇定容至100 mL，于-18 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：使用時(shí)將葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用乙腈逐級(jí)稀釋成所需質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液或混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

選取未成熟期（授粉后25 d）及成熟期（授粉后34 d）甜瓜為實(shí)驗(yàn)材料，隨機(jī)采摘代表性完整甜瓜果實(shí)8～12個(gè)，去蒂去籽后加入液氮粉碎，準(zhǔn)確稱取5.00 g粉碎后甜瓜樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩3 min后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min；取1 mL上清液加入裝有50 mg PSA和50 mg C18的離心管中，充分渦旋振蕩2 min，5 000 r/min離心5 min后取上層清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后，使用乙腈稀釋至合適濃度上機(jī) 檢測(cè)。

1.3.3 色譜條件

XBridge C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸加5 mmol/L乙酸銨溶液，流速為0.20 mL/min。梯度洗脫：0～2.0 min，30% A，70% B；2.0～5.0 min，由30%～60% A，70%～40% B，保持1 min；6.0～10.0 min，60%～100% A，40%～0% B，保持2 min；12.0～12.5 min，100%～30% A，0%～70% B，保持3.5 min，總分析時(shí)長(zhǎng)16 min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正負(fù)離子切換模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子噴霧電壓4.0 kV；霧化氣為氮?dú)猓魉?3.0 L/min；干燥氣為氮?dú)猓魉?0 L/min；碰撞氣為氬氣；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃。7種葫蘆素的檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 7種葫蘆素的的保留時(shí)間與質(zhì)譜參數(shù)條件Table 1 Mass spectrometric parameters and retention times for seven cucurbitacin standards

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

本研究采用注射泵直接將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源的方式對(duì)7種葫蘆素質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。分別將7種葫蘆素質(zhì)量濃度為0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液以10 μL/min的流速將標(biāo)準(zhǔn)工作液注入離子源，離子源為電噴霧離子源。正負(fù)離子模式下7種葫蘆素的一級(jí)質(zhì)譜圖如圖1所示，在正離子模式下，葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫蘆素IIA、葫蘆素B、異葫蘆素B和葫蘆素E在一級(jí)質(zhì)譜中易形成 [M+Na]+離子，這與相關(guān)報(bào)道一致[18,22-23]，但由于 [M+Na]+離子并不穩(wěn)定，在定量分析過程中離子化程度波動(dòng)較大，從而可能引起較大的定量偏差；而當(dāng)在流動(dòng)相中添加5 mmol/L乙酸銨時(shí)，Na+被NH4+取代，形成更加穩(wěn)定且響應(yīng)較高的[M+NH4]+離子，響應(yīng)強(qiáng)度較 [M+Na]+離子提高1.5～2.5 倍[23-24]。而在葫蘆素D與葫蘆素I的一級(jí)質(zhì)譜圖中，[M+H]+和[M+HCOO]-離子峰響應(yīng)較高（圖1f、g）。這可能與葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫蘆素IIA、葫蘆素B、異葫蘆素B和葫蘆素E五種葫蘆素結(jié)構(gòu)均含有酯鍵相關(guān)，有研究表明結(jié)構(gòu)中含有酯鍵的化合物在質(zhì)譜電離過程中易形成[M+NH4]+離子[25]；而葫蘆素D與葫蘆素I在結(jié)構(gòu)中不存在酯鍵，因此分別形成[M+H]+、[M+HCOO]-準(zhǔn)分子離子峰[22,25]。最終優(yōu)化的質(zhì)譜條件如表1所示。

圖1 正負(fù)離子模式下的7種葫蘆素的一級(jí)質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulae and primary mass spectra of seven cucurbitacin standards

2.2 色譜條件優(yōu)化

葫蘆素B和異葫蘆素B為同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，由表1可知，在質(zhì)譜上無法通過離子對(duì)對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，因此需要對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)色譜分離。本研究使用C18色譜柱對(duì)7種葫蘆素進(jìn)行分離，7種葫蘆素都達(dá)到了基線分離，如圖2所示；此外，比較甲醇和乙腈作為流動(dòng)相對(duì)7種葫蘆素的分離及響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙腈為流動(dòng)相時(shí)，7種葫蘆素響應(yīng)較甲醇作為流動(dòng)相時(shí)提高1.2～1.5 倍；當(dāng)在流動(dòng)相中添加甲酸后，葫蘆素D離子化程度更高，且靈敏度增加27%；乙酸銨的加入改善了葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫蘆素IIA、葫蘆素B、異葫蘆素B和葫蘆素E的峰形。綜合考慮靈敏度和色譜峰形等，最終確定采用乙腈和0.1%甲酸加5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在此條件下，7種葫蘆素的色譜峰峰形良好，基質(zhì)干擾小。

圖2 7種葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of seven cucurbitacin standards

2.3 前處理優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較優(yōu)化了5種不同吸附劑（PSA、C18、GCB、Z-Sep、Z-Sep+）及不同含量的吸附劑組合的添加量。使用與甜瓜質(zhì)地相似的蘋果作為空白基質(zhì)，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行前處理，收集第1次離心上清液，使用上清液配制1 mL 7種葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)液樣品溶液（0.1 mg/L），后續(xù)步驟按前處理步驟進(jìn)行，分別計(jì)算其回收率，確定吸附劑種類及添加量。當(dāng)分別使用100 mg Z-Sep、Z-Sep+時(shí)，結(jié)果如圖3a所示，Z-Sep及Z-Sep+兩種吸附劑對(duì)7種葫蘆素均有強(qiáng)烈吸附作用，回收率很低（分別低于9%和10%）；當(dāng)使用GCB作為吸附劑時(shí)，7種葫蘆素回收率為17%～74%，這與目標(biāo)化合物中含有苯環(huán)平面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致與GCB形成了強(qiáng)吸附相關(guān)[26-27]；而當(dāng)采用PSA和C18用作吸附劑時(shí)，7種目標(biāo)葫蘆素的回收率分別為77%～103%和94%～111%，PSA對(duì)色素、有機(jī)酸、脂肪酸及糖等極性干擾物的去除效果好，C18可用于去除極性較小的化合物，基本可滿足凈化需求[28-29]。

為了進(jìn)一步提高甜瓜樣品的凈化效率，采用PSA和C18組合對(duì)甜瓜中7種葫蘆素回收率的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖3b所示，當(dāng)添加PSA和C18的含量分別為100 mg時(shí)，葫蘆素E和葫蘆素I的回收率受到嚴(yán)重影響，分別為62%和58%。而降低PSA和C18的含量，添加50 mg PSA和50 mg C18時(shí)，回收效果較好，7種葫蘆素的回收率為81%～113%。因此，綜合考慮回收凈化效果以及實(shí)驗(yàn)成本，選擇在1 mL提取液中使用50 mg PSA和50 mg C18作為吸附劑，用以凈化甜瓜基質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)。

圖3 葫蘆素在5種不同吸附劑（a）和不同使用量的組合吸附劑（b）中的添加回收率Fig. 3 Effects of five different sorbents, separately (a) and in combination (b), on recoveries of cucurbitacins

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍和檢出限

在0.1～1 500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)配制7種葫蘆素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的峰面積（y）對(duì)其相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按3 倍信噪比得到目標(biāo)化合物的檢出限，10 倍信噪比得到目標(biāo)化合物的定量限，結(jié)果如表2所示，7種葫蘆素檢出限及定量限分別為0.16～4.33 μg/kg和0.27～13.11 μg/kg，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，與文獻(xiàn)中報(bào)道的水平相當(dāng)[22,30]。

表2 7種葫蘆素在甜瓜中的添加回收率及精密度Table 2 Spiked recoveries and precision for seven cucurbitacins

2.4.2 回收率和精密度

同時(shí)使用與甜瓜質(zhì)地相似的蘋果作為空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照1.3.2節(jié)樣品前處理方法制備樣品，平行實(shí)驗(yàn)5 次，分別在20、100 μg/kg和500 μg/kg 3個(gè)水平進(jìn)行添加7種葫蘆素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。7種葫蘆素的加標(biāo)回收率分在75.7%～118.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～13.6%之間，其日內(nèi)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于6.8%、8.3%，能夠滿足日常檢測(cè)需求。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

使用1.3.1節(jié)方法對(duì)不同成熟期的甜瓜進(jìn)行處理，研究發(fā)現(xiàn)除異葫蘆素B外，其余6種葫蘆素在授粉后25 d及授粉后34 d甜瓜中都可被檢測(cè)到，且授粉后34 d甜瓜中葫蘆素總含量較高，為52.24 mg/kg，授粉后25 d甜瓜總葫蘆素含量為46.34 mg/kg（表3）。在不同成熟期甜瓜中，葫蘆素B 含量較高，占總含量的65.0%～65.5%；其次是葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷，占總葫蘆素含量29.9%～31.7%；其余葫蘆素含量均相對(duì)較低，總占比不足總量5%。

表3 實(shí)際樣品中7種葫蘆素測(cè)定結(jié)果及稀釋倍數(shù)（n=4）Table 3 Results of determination of cucurbitacin contents in unripe and ripe melons and corresponding dilution folds (n = 4)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用改良的QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立同時(shí)對(duì)甜瓜中7種葫蘆素的分析方法，對(duì)其質(zhì)譜條件、色譜條件及提取條件進(jìn)行優(yōu)化，在一級(jí)質(zhì)譜中根據(jù)7種葫蘆素不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)選擇了響應(yīng)較高的準(zhǔn)分子離子峰；以乙腈和0.1%甲酸加5 mmol/L 乙酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；并優(yōu)化選擇了50 mg PSA及50 mg C18作為吸附劑對(duì)甜瓜基質(zhì)進(jìn)行凈化，7種葫蘆素的檢出限及定量限分別為0.16～4.33 μg/kg和0.27～13.11 μg/kg，并使用該方法對(duì)不同成熟期甜瓜中的葫蘆素進(jìn)行分析。結(jié)果表明，方法前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、精密度好，可用于甜瓜中多種葫蘆素的同時(shí)檢測(cè)。