鈍頂螺旋藻多糖的分離純化及組成分析

范 斌，羅娟梅，張鴻偉，張曉梅，王 莉，安子哲，盧海燕，趙 雪,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 266001）

螺旋藻為藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、顫藻目、顫藻科的一種微藻[1]。我國螺旋藻養(yǎng)殖量高居世界第一，占國際微藻總產(chǎn)量的40%～50%[2]。螺旋藻中富含多糖（15%～20%）、藻藍(lán)蛋白（20%～28%）、不飽和脂肪酸（6%～13%）、維生素、葉綠素以及胡蘿卜素、硒、鋅和亞麻酸等營養(yǎng)物質(zhì)，被美國食品藥品監(jiān)督管理局譽(yù)為人類的“最佳蛋白來源”，廣泛應(yīng)用于保健食品中[3]。螺旋藻大部分生長在堿性鹽湖，因此其多糖的主要存在形式為酸性雜多糖[4]。研究表明螺旋藻多糖有抗氧化[5-6]、 免疫調(diào)節(jié)[7]、抗病毒[8-9]、降血糖[10-11]、抗腫瘤[12]、腸道調(diào)節(jié)[13]等生物活性。

螺旋藻多糖是一種復(fù)雜的雜多糖，硫酸根含量在6%左右。單糖分析確定其主要含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸，同時(shí)含有少量的木糖、阿拉伯糖、半乳糖、核糖、巖藻糖、半乳糖醛酸等單糖[14]。在不同養(yǎng)殖環(huán)境和提取分離技術(shù)下，螺旋藻多糖的分子質(zhì)量、單糖組成和結(jié)構(gòu)都會(huì)有差異[15-18]。研究表明螺旋藻多糖主要是由葡萄糖、巖藻糖和鼠李糖通過α型糖苷鍵連接的硫酸黏多糖[19]。還含有部分β型糖苷鍵[20]；采用甲基化技術(shù)分析，確定螺旋藻多糖主要是以1,3-連接的鼠李糖為主鏈，在2位或4位有大量分支，而葡萄糖以1,3-連接、甘露糖以1,4-連接的形式位于主鏈或側(cè)鏈中。其中木糖為β構(gòu)型，鼠李糖、葡萄糖和甘露糖醛酸均為α構(gòu)型，并且在鼠李糖的2位或4位可能還有硫酸基團(tuán)[21]。但采用傳統(tǒng)的甲基化和核磁共振分析方法很難解析復(fù)雜的螺旋藻多糖中多種單糖的連接序列和糖鏈的基本組成單元。而多糖降解結(jié)合質(zhì)譜分析是目前解析復(fù)雜多糖的糖鏈組成和結(jié)構(gòu)的有效工具，已經(jīng)用于肝素、硫酸軟骨素和海藻多糖等復(fù)雜的硫酸多糖的結(jié)構(gòu)解析。

為更好地分析螺旋藻中多種糖鏈的精確結(jié)構(gòu)，為螺旋藻多糖的構(gòu)效關(guān)系的提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶酶解、熱水提取、Q-Sepharose Fast Flow（Q-FF）陰離子交換柱法，從鈍頂螺旋藻水溶性多糖中提取和分離純化出5個(gè)多糖組分，分析比較不同多糖組分的基本化學(xué)組成。采用熱降解結(jié)合親水液相色譜-高分辨傅里葉轉(zhuǎn)換質(zhì)譜（hydrophilic interaction liquid chromatography-Fourier transform mass spectrometry，HILIC-FTMS）聯(lián)用技術(shù)，進(jìn)一步解析螺旋藻多糖糖鏈的寡糖片段和精確組成，以期為螺旋藻多糖的產(chǎn)品開發(fā)和高值化利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻粉 云南生物工程有限公司。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（重均分子質(zhì)量5 220、11 600、48 600、147 600、27 300 Da）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖） 美國Sigma公司；Q-FF陰離子交換色譜 美國Amersham Pharmacia Biotech公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀、ICS-2000離子色譜儀 美國Agilent公司；OHpak SB-804HQ柱（8.0 mm×300 mm，10 μm） 日本Shodex公司； Q-FF陰離子色譜填料（8 cm×30 cm） 美國GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；Luna HILIC親水液相色譜柱（2.0 mm×150 mm，3 μm） 美國 Phenomenex公司；IonPac AG11-HC離子色譜柱（4 mm×50 mm，9 μm）、IonPac AS11-HC離子色譜柱（4 mm×250 mm，9 μm）、UltiMate3000高效液相色譜儀、Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀、傅里葉紅外光譜儀 美國 Thermo Fisher公司；真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司； MLS-3750高溫高壓滅菌鍋 日本Sanyo株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取和純化

稱取100 g鈍頂螺旋藻藻粉，加入干冰中充分研磨破壁。分別加入用甲醇、石油醚-三氯甲烷（2∶1，V/V）進(jìn)行脫色脫脂。然后藻體中加入3 L 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液、10 g木瓜蛋白酶、15 mmol EDTA-Na2、15 mmolL-半胱氨酸，于50 ℃水浴酶解24 h。水解液1 700×g離心15 min，收集上清液。將上清液濃縮后，加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%，4 ℃醇沉24 h，然后1 700×g離心15 min。取沉淀用蒸餾水溶解，溶液用截留分子質(zhì)量為8 000～10 000 Da的透析袋透析。透析液真空旋轉(zhuǎn)濃縮、凍干，得到粗多糖。

1.3.2 陰離子交換色譜法分離純化多糖

將1 g粗多糖溶入100 mL磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8），加入Q-FF陰離子色譜柱（8 cm×30 cm），依次以濃度為0、0.2、0.4、0.6 mol/L 和0.8 mol/L的NaCl磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8）進(jìn)行梯度洗脫。收集洗脫液，用截留分子質(zhì)量為8 000～10 000 Da的透析袋透析脫鹽，透析液濃縮、凍干后，分別得到P0、P0.2、P0.4、P0.6、P0.8五個(gè)多糖組分。

1.3.3 糖的熱降解

采用高溫降解法[22]，將多糖用超純水配制成 10 mg/mL溶液，用10%醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH 5。取1 mL多糖溶液放于高壓高溫滅菌鍋中，100 ℃加熱降解30 min，然后冷凍干燥，得到多糖的熱降解產(chǎn)物。

1.3.4 多糖的總糖含量測定

準(zhǔn)確稱量鼠李糖40 mg于500 mL容量瓶中溶解定容。分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 mL糖溶液于10 mL試管中，各加蒸餾水至2 mL，然后加入1 mL 6%的苯酚溶液和5.0 mL 98%濃硫酸，立刻搖勻，置于沸水浴中反應(yīng)15 min。反應(yīng)完畢，立即取出放入冰水浴中迅速冷卻，使用酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)液在490 nm的OD值。以上述不同質(zhì)量濃度鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際測定的質(zhì)量濃度x（mg/mL）和OD值y作圖，得到多糖的回歸曲線方程y= 3.462 1x+0.082 8（R2= 0.986 1）。取0.2 mL樣品溶液（2 mg/mL），同上反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總糖含量。

1.3.5 多糖的分子質(zhì)量測定

用0.1 mol/L Na2SO4配制成5 mg/mL溶液，采用高效凝膠排阻色譜法進(jìn)行分子質(zhì)量分析[23]。選用1260高效液相色譜儀，色譜柱OHpak SB-804HQ柱（8.0 mm×300 mm，10 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L Na2SO4溶液，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，采用示差檢測器檢測。使用分子質(zhì)量為5 220、11 600、48 600、147 600 Da和27 300 Da的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間x（tR）和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)y（lgM）作圖，得到回歸曲線方程y=-0.362 3x+10.338 9，R2=0.997 0，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖的分子質(zhì)量。

1.3.6 多糖的硫酸根含量測定

采用離子色譜法[24]，以無水硫酸鉀作為標(biāo)準(zhǔn)品，110 ℃烘干4～5 h后，準(zhǔn)確稱取0.4 g標(biāo)準(zhǔn)品定容于1 L容量瓶中，體積法稀釋獲取質(zhì)量濃度為25、50、100、150、200、300 μg/mL和400 μg/mL的硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后利用離子色譜儀測定標(biāo)準(zhǔn)品中硫酸根的含量，以標(biāo)準(zhǔn)品硫酸根質(zhì)量濃度x（μg/mL）和峰面積y（μS·min）作圖，得到回歸曲線方程y=0.169 6x-0.499 3（R2=0.996 6）。

取2 mg多糖于安瓿瓶中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，吹入N2后封瓶，然后再110 ℃消化8 h。消化完畢后，用氮?dú)獯蹈扇宜?，用超純水定容?0 mL。采用離子色譜檢測溶液中硫酸根的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的硫酸根含量。

離子色譜儀參數(shù)設(shè)置：ICS-2000離子色譜儀；分離柱：IonPac AS11-HC（4 mm×250 mm，9 μm）；保護(hù)柱：IonPac AG11-HC（4 mm×50 mm，9 μm）；抑制器：ASRS ULTRA（陰離子抑制器）抑制電流90 mA；檢測器：電導(dǎo)檢測器；淋洗液及流速：20 mmol/L KOH溶液（試劑盒），1.2 mL/min；程序時(shí)間8 min；數(shù)據(jù)采集速率5.0 Hz；進(jìn)樣體積25 μL。

1.3.7 多糖的單糖組成分析

采用PMP柱前衍生-高效液相色譜法分析鈍頂螺旋藻多糖中的單糖組成[25]。將樣品配成10 mg/mL溶液，取200 μL加入安瓿瓶中，然后加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，吹N2后封瓶，110 ℃水解4 h后，吹干三氟乙酸，用超純水定容200 μL。取110 μL樣品加入10 μL乳糖（20 mmol/L，內(nèi)標(biāo)），然后加入130 μL、0.3 mol/L NaOH和150 μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生劑，在70℃水浴反應(yīng)30 min。取出樣品后加入130 μL、0.3 mol/L HCl終止反應(yīng)后，加入三氯甲烷反復(fù)萃取除去多余的PMP衍生劑。取上層水相200 μL，稀釋3 倍，進(jìn)高效液相色譜分析?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖11種單糖和乳糖內(nèi)標(biāo)組成（均為20 mmol/L），各取10 μL混勻，按照上述方法進(jìn)行PMP衍生。

高效液相色譜參數(shù)：1260高效液相色譜儀；色譜柱：Agilent EC-C18分離柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；檢測器：245 nm紫外檢測器；流速：0.4 mL/min； 柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）-乙腈（82∶18，V/V）；B為0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）-乙腈（65∶35，V/V）；流動(dòng)相梯度洗脫：0～55 min，98%～90% A、2%～10% B；55～56 min，90%～0% A、10%～100% B；56～58 min，0% A、100% B；58～59 min，0%～98% A、100%～2% B；59～60 min，98% A、2% B；進(jìn)樣體積20 μL。

1.3.8 多糖的紅外光譜分析

將0.5 mg鈍頂螺旋藻多糖與150 mg無水溴化鉀混合，并在干燥條件下壓制成片[26]。使用傅里葉紅外光譜儀，以2 cm-1的數(shù)據(jù)采集速率記錄多糖的紅外光譜，范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.9 多糖降解產(chǎn)物的HILIC-FTMS聯(lián)用分析

將多糖降解產(chǎn)物用超純水溶解為10 mg/mL。取150 μL糖溶液，與乙腈按體積比1∶1混合均勻后，7 378×g離心5 min。將上清液用0.22 μm超濾膜進(jìn)行過濾，收集濾液。取8 μL進(jìn)行HILIC-FTMS分析[27]。

液相色譜參數(shù)：選用Luna HILIC親水液相色譜柱；流動(dòng)相：A為5 mmol/L醋酸銨溶液，B為98%乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫：0～30 min，2%～10% A、98%～90% B；30～40 min，10%～35% A、90%～65% B；40～50 min，35%～2% A、65%～98% B；50～60 min，2% A、98% B；流速150 μL/min。

高分辨-傅里葉轉(zhuǎn)換質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：使用Q-Exactive質(zhì)譜，電噴霧電壓4.2 kV；毛細(xì)管電壓40 V；套管透鏡補(bǔ)償電壓-50 V；毛細(xì)管溫度275 ℃；鞘層氣體流量 30 L/min；輔助氣體的流量6 L/min；掃描時(shí)間1～50 min，分子質(zhì)量范圍100～1 500 Da。

1.4 數(shù)據(jù)分析及圖表繪制

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s表示。圖形繪制用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈍頂螺旋藻不同多糖組分的基本化學(xué)組成分析比較

為研究螺旋藻多糖的種類和結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶酶解、熱水提取和強(qiáng)陰離子交換色譜法，從鈍頂螺旋藻中提取和分離純化出5個(gè)多糖組分P0、P0.2、P0.4、P0.6和P0.8。表1為5個(gè)多糖組分的化學(xué)組成分析比較。苯酚-硫酸法測得鈍頂螺旋藻多糖各組分總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%～90%，純度較高。P0、P0.2、P0.4、P0.6的硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在6%左右，得率為20%～30%；而P0.8組分的硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到14.46%，但是該組分得率只有1.25%，且脫鹽操作繁瑣，因此不適合開發(fā)利用。

表1中不同多糖組分的單糖組成分析發(fā)現(xiàn)，P0組分是一種葡聚糖，葡萄糖物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為77.49%，而半乳糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、巖藻糖物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)在2%～6%之間；P0.2組分是一個(gè)非常復(fù)雜的中性硫酸多糖，含有10種單糖，主要由葡萄糖（30.00%）、半乳糖（18.32%）、鼠李糖（12.72%）、巖藻糖（10.68%）等中性糖組成的雜多糖；而P0.4組分是一個(gè)非常復(fù)雜的硫酸鼠李聚糖，鼠李糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.46%，同時(shí)含有比較高的葡萄糖醛酸（14.91%）、葡萄糖（13.48%）、半乳糖（13.58%）和巖藻糖（11.26%）；而P0.6組分主要由鼠李糖（45.81%）和葡萄糖醛酸（20.75%）組成的低硫葡萄糖醛酸鼠李聚糖。各個(gè)組分的單糖組成液相色譜圖見圖1。比較發(fā)現(xiàn)，P0.8組分與P0.6組分單糖組成非常相似，但是其硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于P0.6組分，達(dá)到14.46%。

表1 鈍頂螺旋藻不同多糖組分的化學(xué)組成的比較Table 1 Comparison of chemical composition of polysaccharide fractions from S. platensis %

圖1 鈍頂螺旋藻多糖不同組分的單糖組成液相色譜圖Fig. 1 HPLC aprofiles showing the monosaccharide composition of different polysaccharide fractions from S. platensis

2.2 多糖的紅外光譜分析

鈍頂螺旋藻4個(gè)多糖組分的紅外光譜分析的比較（圖2） 可知，鈍頂螺旋藻多糖P0～P0.6樣品在3 354 cm-1附近均有強(qiáng)的O—H的伸縮振動(dòng)峰，1 397 cm-1附近的O—H 的彎曲振動(dòng)峰，結(jié)合1 028 cm-1附近的C—O—C碳水化合物骨架的伸縮振動(dòng)峰，其為糖類共有的官能團(tuán)；4個(gè)多糖組分在2 930 cm-1附近有C—H的伸縮振動(dòng)峰，說明可能存在鼠李糖和巖藻糖的甲基或其他飽和碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)；在1 651 cm-1附近有COO—和—NHCOCH3的 C＝O鍵的伸縮振動(dòng)和非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，以及N—H鍵的彎曲振動(dòng)；1 543.10 cm-1處是＝CH2的變形吸收峰；P0和P0.2組分在1 543 cm-1有N—H的彎曲振動(dòng)峰，說明含有—NH—；1 240 cm-1附近較小的吸收峰為S＝O伸縮振動(dòng)峰，證明4個(gè)多糖組分都含有少量硫酸根。

圖2 鈍頂螺旋藻多糖中不同組分的紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of different polysaccharide fractions from S. platensis

2.3 多糖的分子質(zhì)量測定結(jié)果

圖3和表2為高效凝膠排阻色譜法對(duì)不同多糖組分及其降解產(chǎn)物分子質(zhì)量的分析。P0和P0.2多糖組分中主要由分子質(zhì)量為5.21 kDa（64.13%）和40.92 kDa（65.36%）的組分構(gòu)成，還含有少量的分子質(zhì)量為1 047 kDa（23.73%）和1 207 kDa（9.79%）的高分子質(zhì)量多糖。而P0.4和P0.6多糖組分的分子質(zhì)量低于P0和P0.2組分，主要含有分子質(zhì)量180 kDa和167 kDa的多糖組分，還含有少量的分子質(zhì)量小于1 kDa的組分。為了進(jìn)一步分析鈍頂螺旋藻多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用熱降解法在100 ℃、pH 5.0降解鈍頂螺旋藻多糖30 min。如表2所示，各多糖組分的分子質(zhì)量顯著下降，分子質(zhì)量小于1 kDa的寡糖相對(duì)比例升高。

圖3 鈍頂螺旋藻多糖不同組分（A）及其降解產(chǎn)物（B）的 高效凝膠排阻色譜分析Fig. 3 HPSEC profiles of different polysaccharide fractions from S. platensis (A) and their degradation products (B)

表2 鈍頂螺旋藻多糖不同組分及其降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular mass distribution of polysaccharide fractions from S. platensis and their degradation products

2.4 P0.2組分的熱降解產(chǎn)物中寡糖的組成和糖鏈組成分析

因?yàn)槁菪宥嗵墙M成復(fù)雜，因此本實(shí)驗(yàn)利用熱降解結(jié)合HILIC-FTMS，分析鈍頂螺旋藻多糖降解產(chǎn)物中寡糖全指紋圖譜。由于高分辨質(zhì)譜的分析能力強(qiáng)，可以更全面地解析出降解產(chǎn)物中所有的寡糖組成，包括相對(duì)豐度低于0.1%的微量寡糖產(chǎn)物，從而解析出鈍頂螺旋藻多糖的糖鏈上寡糖片段的組成特征，揭示多糖糖鏈的精細(xì)組成。因?yàn)镻0組分主要為葡聚糖，P0.8組分的得率太低，因此本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)P0.2、P0.4和P0.6三個(gè)組分在100 ℃ pH 5.0降解30 min的產(chǎn)物進(jìn)行HILIC-FTMS分析。

采用HILIC-FTMS法分析鈍頂螺旋藻P0.2組分的熱降解產(chǎn)物，共發(fā)現(xiàn)了52個(gè)寡糖，相對(duì)豐度為0.01%～23.70%。表3為其中主要的22種寡糖的分子質(zhì)量和相對(duì)豐度的比較。分析發(fā)現(xiàn)，P0.2組分降解產(chǎn)物中主要有己糖單糖Hex1（23.70%）、戊糖二糖（Pent2，17.55%；Pent2S1，6.23%）和三糖（Pent3，1.53%）、硫酸脫氧己糖Deoxyhex1S1（9.61%），其中己糖（Hex）可能是葡萄糖、半乳糖或甘露糖，戊糖可能是木糖和阿拉伯糖，脫氧己糖可能是巖藻糖或鼠李糖。說明P0.2糖鏈上主要是己糖、戊糖二糖、三糖和硫酸脫氧己糖組成。硫酸根主要分布在脫氧己糖和戊糖上；在降解產(chǎn)物中，脫氧己糖-戊糖的二糖和三糖（Deoxyhex1-2Pent1-2）占總寡糖相對(duì)豐度的18.25%，同時(shí)還存在脫氧己糖-糖醛酸、脫氧己糖-己糖（Deoxyhex2GlcA1-2（6.10%）、Deoxyhex2-3Hex1-2（2.2%）），說明該糖鏈的脫氧己糖上主要連接有戊糖，同時(shí)也有部分與糖醛酸和己糖連接。熱降解產(chǎn)物中大量四糖Deoxyhex1-2Pent2-3Hex1和Deoxyhex2Pent1HexNA2的存在，也進(jìn)一步說明P0.2組分中主鏈由脫氧己糖、糖醛酸、中性己糖和乙酰氨基己糖的寡糖片段組成。

表3 鈍頂螺旋藻多糖組分P0.2熱降解產(chǎn)物中主要22個(gè)寡糖的 結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度Table 3 Structure and relative abundance of 22 oligosaccharides identified in the degradation products of P0.2

2.5 P0.4組分的熱降解產(chǎn)物中寡糖的組成和糖鏈組成分析

利用HILIC-FTMS法分析多糖組分P0.4的熱降解產(chǎn)物，共解析出65個(gè)寡糖，相對(duì)豐度為0.01%～20.99%。表4為其中28個(gè)主要寡糖的分子質(zhì)量和相對(duì)豐度的比較。單糖組成分析說明P0.4組分主要由鼠李糖組成，鼠李糖（30%）的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于巖藻糖（11%），因此認(rèn)為糖鏈中的脫氧己糖主要是鼠李糖。在降解產(chǎn)物中，鼠李糖-戊糖（Rha1-4Pent1-2）寡糖相對(duì)豐度最高（29.78%），尤其是三糖Rha2Pent1最高，達(dá)到17.39%，說明糖鏈上主要是Rha-Rha-Pent的三糖重復(fù)單元和其他鼠李糖-戊糖寡糖片段組成，每1～2個(gè)鼠李糖上就連接1個(gè)戊糖；降解產(chǎn)物中鼠李糖-糖醛酸寡糖（Rha1-4GlcA1）占24.04%，尤其是二糖Rha1GlcA1的相對(duì)豐度最高，達(dá)到20.99%，說明糖鏈上有大量的鼠李糖-糖醛酸寡糖，其中Rha-GlcA的重復(fù)二糖的相對(duì)豐度最高；寡糖中只有微量的Rha4Hex1和Rha1HexNA2，說明只有微量的己糖和乙酰氨基己糖連接在鼠李糖上；降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了聚合度1～3的鼠李糖寡糖（Rha1-3S0-1），其中單硫鼠李糖Rha1S1的相對(duì)豐度最高，說明部分鼠李糖上有1個(gè)硫酸根取代。

表4 鈍頂螺旋藻多糖組分P0.4熱降解產(chǎn)物中主要28個(gè)寡糖的 分子質(zhì)量和相對(duì)豐度的比較Table 4 Molecular mass and relative abundance of 28 oligosaccharides identified in the degradation products of P0.4

P0.4組分降解產(chǎn)物中大量聚合度1～3的戊糖寡糖（Pent1-3，15.47%），說明糖鏈上有大量的戊糖二糖和戊糖三糖的片段，戊糖上有部分硫酸根取代；戊糖-乙酰氨基己糖寡糖Pent1-2HexNA1-2的存在說明戊糖上連接有少量的乙酰氨基己糖；而P0.4組分中己糖Hex只有5.36%，顯著低于P0.2組分，微量的Hex1GlcA1和Hex1-2HexNA1-2的存在說明少量的己糖與葡萄糖醛酸和乙酰氨基己糖連接片段。Rha2Pent1GlcA1S2、Rha1Hex2GlcA1S1、Rha1Hex1HexA1為糖鏈中占比最高的寡糖片段。

2.6 P0.6組分的熱降解產(chǎn)物中寡糖的組成和糖鏈組成分析

采用HILIC-FTMS法分析P0.6組分的熱降解產(chǎn)物，共解析出65個(gè)寡糖，相對(duì)豐度為0.01%～19.37%， 表5為其中主要的24個(gè)寡糖的分子質(zhì)量和相對(duì)豐度的比較。P0.6組分的降解產(chǎn)物中寡糖的組成與P0.4非常相似，主要由單硫鼠李糖（Rha1S1）、鼠李糖-戊糖寡糖 （Rha1-2Pent1-2）、鼠李糖-糖醛酸寡糖（Rha1-2GlcA1-2）和戊糖寡糖（Pent1-3）組成；但是P0.6組分中鼠李糖-糖醛酸寡糖（21%）高于鼠李糖-戊糖寡糖（14.36%）的相對(duì)豐度，糖鏈主要由Rha-GlcA（19.37%）和Rha-Pent（10.69%）二糖重復(fù)單元組成；同時(shí)該糖鏈中發(fā)現(xiàn)具有10%的鼠李雜糖九糖（Rha5Hex1Pent1HexNA2S2）和十糖（Rha3Hex6Pent1S4）片段。但是P0.6中只有微量的己糖Hex和己糖寡糖，與單糖組成結(jié)果一致，說明P0.6組分的糖鏈主要是由單硫鼠李糖寡糖、鼠李糖-戊糖寡糖、鼠李糖-糖醛酸寡糖和戊糖寡糖組成。

表5 鈍頂螺旋藻多糖組分P0.6熱降解產(chǎn)物中主要24個(gè)寡糖的 分子質(zhì)量和相對(duì)豐度的比較Table 5 Molecular mass and relative abundance of 24 oligosaccharides identified in the degradation products of P0.6

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶酶解、水提取、醇沉、QFF-陰離子交換色譜法，從鈍頂螺旋藻中提取和分離純化出P0、P0.2、P0.4、P0.6、P0.8五種結(jié)構(gòu)不同的多糖組分。分析發(fā)現(xiàn)，5種多糖的分子質(zhì)量在167～1 432 kDa之間，分布比較廣。P0、P0.2、P0.4、P0.6四個(gè)組分硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%～7%，只有P0.8組分硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到14.46%，但是其得率只有1.25%。說明鈍頂螺旋藻多糖主要是由低硫多糖組成。單糖組成分析結(jié)果說明，P0組分是一種葡聚糖，P0.2組分主要由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖等中性糖組成的雜多糖；而P0.4、P0.6和P0.8組分主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖組成的非常復(fù)雜的硫酸鼠李聚糖，其中P0.6和P0.8組分的鼠李糖含量達(dá)到50%，主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸組成。分析結(jié)果說明，鈍頂螺旋藻中存在多種結(jié)構(gòu)完全不同的低硫酸多糖，其中葡萄糖醛酸-鼠李聚糖是鈍頂螺旋藻中特有的一種硫酸多糖。采用陰離子交換色譜技術(shù)，可以從鈍頂螺旋藻粗多糖中去除葡聚糖和雜多糖的雜質(zhì)，分離出純度高的硫酸鼠李聚糖。

因?yàn)殁g頂螺旋藻多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使用傳統(tǒng)核磁共振方法很難解析其結(jié)構(gòu)。因此本實(shí)驗(yàn)采用熱降解法降解鈍頂螺旋藻多糖，然后利用HILIC-FTMS聯(lián)用技術(shù)，分析從多糖糖鏈上降解下來的寡糖組成，從而解析鈍頂螺旋藻多糖糖鏈的寡糖片段和糖鏈組成。HILIC-FTMS分析P0.2的熱降解產(chǎn)物說明，P0.2的糖鏈主要是由己糖單糖、戊糖二糖和三糖、脫氧己糖-戊糖寡糖、脫氧己糖-糖醛酸寡糖等寡糖片段組成，硫酸根在脫氧己糖、戊糖和己糖上。而P0.4和P0.6兩個(gè)組分的糖鏈結(jié)構(gòu)相似，主要鼠李糖-戊糖寡糖、鼠李糖-葡萄糖醛酸寡糖、戊糖二糖和三糖片段組成，硫酸根連接在鼠李糖和戊糖上。研究證明，離子交換色譜、熱降解和HILIC-FTMS聯(lián)用技術(shù)，是分析鈍頂螺旋藻中復(fù)雜的硫酸多糖糖鏈的精細(xì)組成的有效技術(shù)。下一步需要利用高效液相色譜-多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)解析寡糖的結(jié)構(gòu)和序列，可以進(jìn)一步解析鈍頂螺旋藻多糖糖鏈的精確結(jié)構(gòu)，為鈍頂螺旋藻多糖的開發(fā)利用提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。