不同品種蓮藕游離氨基酸多樣性分析

顧曉敏，童 川，韓延超，陳杭君，郜海燕

（浙江省農業科學院食品科學研究所，農業農村部果品產后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，中國輕工業果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江 杭州 310021）

蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn.），又名藕、荷藕等，是一種多年生水生蔬菜[1]，在我國湖北、江蘇、浙江等地區廣泛種植[2]。2019年僅湖北省蓮藕種植面積達10.56萬 hm2，產量達217.2萬 t[3]。蓮藕含有約80%水、17.64%淀粉、3.67%總膳食纖維、2.56%蛋白質等成分，營養物質豐富[4-5]。此外，還含有大量的生物堿、類黃酮、多酚等藥用成分[6-7]，具有清除自由基、抗氧化和降血糖等生理功效[8-9]。目前，蓮藕營養與加工品質、貯藏保鮮等研究逐漸受到重視。Li Shuyi等[10]將蓮藕切片分別在40、50、60 ℃處理30 min后，發現濕熱處理能夠使蛋白質質量分數增加29%～36%。孫其然等[1]在蓮藕及下腳料中檢測到糖類、核苷類、蛋白質及20種氨基酸，包括人體必需的9種氨基酸。

氨基酸以兩種形式存在于植物中：一種是游離態形式；另一種以結合態的形式存在于肽和蛋白質中。氨基酸種類及含量影響植物的生長、成熟和衰老[12]。自然界中氨基酸種類多達150多種，但是在生物體中僅有20多種，分為必需氨基酸（essential amino acids，EAA）和非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA），是人類身體代謝不可或缺的一種重要營養元素[13]。已有研究表明，蓮藕中含有16種氨基酸，總含量為5.96%～15.75%，其中，異亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）等9種人體EAA含量為1.47%～3.47%，亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）等8種NEAA含量為4.49%～12.22%[14]。除了品種與種植環境因素外，貯藏方式、加工方法等也會導致蓮藕氨基酸組分與含量產生較大差異。張永清等[15]使用蒲公英提取物對蓮藕進行保鮮，研究發現隨著貯藏時間的延長，游離氨基酸含量呈下降趨勢，與對照組相比，蒲公英提取物處理后樣品在貯藏4、8、12、16 d后氨基酸含量分別減少了23.37%、27.12%、59.51%、72.62%；而使用異抗血酸鈉作為保鮮劑處理鮮切蓮藕則發現，隨著貯藏時間的增長，蓮藕游離氨基酸含量呈先下降后上升的趨勢，說明游離氨基酸參與細胞壁的代謝活動，同時外源酶又分解細胞中的蛋白質，使氨基酸含量有所提高[16]。Shukla等[17]將蓮藕制成糖漿并分析貯藏后氨基酸含量的變化，發現貯藏0 d蓮藕糖漿中游離氨基酸質量濃度為5.74 μg/mL，而在貯藏15、90、180 d分別為262.95、317.1、351.44 μg/mL，表明氨基酸含量隨著貯藏時間的延長而不斷提高。姚祥坦等[18]通過研究“藕-魚”“菱-魚”共生種養結合模式下蓮藕的生長狀況發現，低洼田濕地農業“藕-魚”共生種養結合模式種植的蓮藕中氨基酸含量提高了11.3%。游離氨基酸不僅是一種重要的營養物質，同時也是重要的呈香物質，表現出鮮、甜、酸、苦及澀等味感，這些味感形成了食物豐富的味覺層次[19]。因此，明確蓮藕中游離氨基酸種類、含量以及呈味特性，對提高蓮藕加工制品的營養與品質具有重要意義。

基于上述，關于蓮藕氨基酸的研究主要集中在加工方式、貯藏條件以及種植方式等對其組分及含量的影響，針對不同品種蓮藕氨基酸含量與組分的研究報道較少。本研究分析28個不同品種蓮藕的游離氨基酸組分及含量，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析對其進行綜合評價，以期為蓮藕營養與風味品質評價、品種篩選及產品開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料為收集的28 份蓮藕主栽品種與地方品種，具體信息見表1。均于2019年3月下旬種植于浙江省金華市農業科學研究院實驗基地，栽培條件相同；為排除采后成熟度對其品質的影響，28個不同品種蓮藕均于2020年1月10日采收。新鮮蓮藕采收當天運回實驗室，4 ℃貯存。挑選大小均勻，無病害、無機械損傷的食用部位用于實驗研究。

表1 蓮藕品種名和產地Table 1 Geographical sources of lotus varieties used in this experiment

17種氨基酸混合標準品（天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、Gly、Ala、半胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、Ile、Leu、酪氨酸（Tyr）、Phe、His、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）） 美國Sigma公司；氨基酸測定用流動相W、R 德國曼默博爾公司。

1.2 儀器與設備

A300全自動氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司；XMTD-8222水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；Stratos 64R高速低溫冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；A11BS025磨樣機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗樣品前處理

參考GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測定》[20]。每份材料分別選取3個完整、無機械損傷的蓮藕塊莖食用部位，經去皮、切塊、混合后，使用磨樣機粉碎。準確稱取0.5 g樣品于25 mL試管中，加入10 mL超純水，90 ℃水浴20 min，期間搖晃一次。室溫放置，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，使用0.22 μm水系濾頭過濾，保存備用。

1.3.2 氨基酸測定

采用氨基酸全自動分析儀進行氨基酸測定。程序為Hydrolysate Standard，鋰鹽柱分析柱，Pressure E壓力25～40 bar，Pressure R壓力8～12 bar，茚三酮流速240 μL/min，流動相W和R流速120 μL/min，柱溫40 ℃，反應器溫度115 ℃，進樣量30 μL；混合標準品溶液濃度62.5 nmol/mL。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（Duncan多重比較）和Pearson相關性分析。使用Simca 14統計軟件進行PCA和聚類分析。每組樣品均進行3 次測定，用平均值作為實驗結果。

2 結果與分析

2.1 不同品種蓮藕氨基酸組分及含量差異

從氨基酸組成看，28個不同品種蓮藕氨基酸種類無差異，均含有Cys、Asp、Thr、Ser等17種氨基酸，與姚祥坦[21]等報道結果一致。圖1為‘粗卜’蓮藕的氨基酸譜圖。亢金秀等[22]在‘鄂蓮6號’中僅檢測到16種氨基酸組分，未檢測到Cys，這可能是樣品前處理方法不同所導致。由表2可知，各氨基酸組分存在顯著的品種差異性，EAA、NEAA、總氨基酸（total amino acid，TAA）平均含量分別為2.05、12.27、14.33 mg/g，但不同品種蓮藕中EAA、NEAA、TAA含量均存在顯著差異，這與姚祥坦等[21]的報道結果相近。‘金華無籽藕’（L01）EAA含量最高，為3.08 mg/g；‘細卜’（L08）NEAA、TAA含量均最高，分別為14.81、17.84 mg/g。‘金藕4號’（L04）EAA含量最低，為1.04 mg/g，‘武義白姆食用藕’（L21）NEAA、TAA含量均最低，分別為8.22、10.82 mg/g。

圖1 ‘粗卜’蓮藕氨基酸圖譜Fig. 1 Chromatogram showing amino acid composition of ‘Cubo’ lotus rhizomes

表2 不同品種蓮藕氨基酸組分Table 2 Free amino acid composition of different cultivars of lotus rhizomes

蓮藕中游離氨基酸的平均含量為由高到低依次為 Glu＞Arg＞Phe＞Thr＞Tyr＞Asp＞Ser＞Val＞Ile＞His＞ Ala＞Lys＞Leu＞Cys＞Met＞Pro＞Gly，其中Glu含量約占TAA含量的66%，分別約為Arg、Phe、Thr、Met、Pro、Gly含量的5、14、31、104、117、472 倍。上述結果表明，盡管28個不同品種蓮藕種植環境相同，但是其氨基酸含量仍差異很大，存在顯著的品種多樣性。

2.2 不同品種蓮藕呈味氨基酸分析

氨基酸能夠使食物具有特殊的風味[23]。蓮藕口感清甜鮮美，與其所含豐富的呈味游離氨基酸有關。游離氨基酸呈味特性可分為鮮味氨基酸（Glu、Asp、Lys）、甜味氨基酸（Thr、Gly、His、Ala、Pro、Ser）、苦味氨基酸（Met、Arg、Val、Leu、Ile）和芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Cys）4 類[24]。由表3可知，蓮藕鮮味氨基酸含量為8.57～11.47 mg/g，平均含量為9.89 mg/g，占TAA平均含量的69%；‘細卜’（L08）是鮮味氨基酸含量最高的品種，含量達 11.47 mg/g，約占其TAA含量的64%。蓮藕甜味氨基酸含量為0.46～2.04 mg/g，平均含量為0.99 mg/g；‘金華無籽藕’（L01）甜味氨基酸含量最高，為 2.04 mg/g，約占其TAA含量的12%。蓮藕苦味氨基酸含量為1.08～3.59 mg/g，平均含量為2.36 mg/g；‘紅花藕’（L09）含量最高，為3.59 mg/g，約占其TAA含量的22%。蓮藕芳香族氨基酸含量為0.60～1.55 mg/g，平均含量為1.06 mg/g。‘金華無籽藕’（L01）芳香族氨基酸含量最高，為1.55 mg/g，約占其TAA含量的9%。蓮藕中含量最高的氨基酸為Glu（表2），Glu是一類重要的鮮味氨基酸[25]，在蓮藕鮮味中發揮關鍵作用。28個不同品種蓮藕中，‘細卜’（L08）是鮮味氨基酸含量最高的品種（11.47 mg/g），并且甜味氨基酸（1.54 mg/g）、芳香族氨基酸（1.49 mg/g）含量均較高，說明其口感較好。不同品種蓮藕呈味氨基酸含量由高到低依次為：鮮味氨基酸＞苦味氨基酸＞芳香族氨基酸＞甜味氨基酸，說明蓮藕口感整體較好。

表3 不同品種蓮藕呈味氨基酸含量Table 3 Contents of taste-active amino acids in different cultivars of lotus rhizomes

2.3 不同品種蓮藕氨基酸含量相關性分析

對蓮藕中17種氨基酸含量進行相關性分析，結果如表4所示。Arg含量與Glu、Gly、Ala、Phe含量之間無顯著相關，與Ser、Pro顯著相關（P＜0.05）；Glu含量與Gly含量顯著相關（P＜0.05），Met含量與Phe含量顯著相關（P＜0.05）；其余氨基酸含量間均極顯著相關 （P＜0.01），表明各氨基酸組分間相關性較強。

表4 不同品種蓮藕中游離氨基酸含量相關性分析Table 4 Correlation analysis between free amino acid contents in different cultivars of lotus rhizomes

2.4 同品種蓮藕游離氨基酸的PCA

PCA方法可將彼此間具有相關性的較多指標簡化為相對獨立或相關性較小的幾個具有代表性的指標，保留絕大部分原始信息，較單一評價更快捷、準確，同時避免了性狀間的相關性影響評價結果[26-27]，目前已廣泛用于評價不同品種大豆[28]、地參[29]、楊梅[27]等農產品的品質。對不同品種蓮藕游離氨基酸進行PCA發現，不同品種的蓮藕樣品分別集中于不同區域（圖2）。L08（‘細卜’）、L25（‘馬口白蓮’）、L10（‘金花紅蓮’）、L27（‘江蘇無花藕’）、L26（‘東河早藕’）、L17（‘蘇州食用藕’）位于第1象限，但L08（‘細卜’）遠離其他品種，說明除L08外，其他品種蓮藕的游離氨基酸成分組成和含量相近；L09（‘紅花藕’）、L22（‘湖州中白荷’）、L18（‘杭州藕’）位于第2象限；L04（‘金藕4號’）、L05（‘金藕2號’）、L14（‘武義柳城食用藕’）、L15（‘湖州早白荷’）、L19（‘鄂蓮9號’）、L20（‘金藕3號’）、L07（‘武義食用藕’）、L12（‘金華白蓮’）、L11（‘鄂蓮7號’）位于第3象限；L24（‘紹興紅花藕’）、L06（‘鄂蓮新品系’）、L28（‘金華小花食用藕’）、L21（‘武義白姆食用藕’）、L03（‘鄂蓮5號’）、L01（‘金華無籽’）位于第4象限，但L21（‘武義白姆食用藕’）、L03（‘鄂蓮5號’）、L01（‘金華無籽藕’）遠離其他品種，說明這3個品種蓮藕的游離氨基酸含量和組成與其他品種差異較大。L02（‘金藕1號’）、L23（‘粗卜’）、L24（‘紹興紅花藕’）位于縱軸上，說明其主要受PC2影響；L16（‘鄂蓮1號’）、L14（‘武義柳城食用藕’）位于橫軸上，說明其主要受PC1影響。

圖2 不同蓮藕品種的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot for different lotus rhizomes

2.5 不同品種蓮藕游離氨基酸的綜合評價

由表5可知，前3個PC累計方差達到80.16%，因此利用前3個PC對不同品種蓮藕進行綜合評價是可行的。以17個游離氨基酸指標為初始自變量，經PCA最終得出3個PC因子的方程表達式如下：

表5 總方差分析結果Table 5 Eigenvalues of first three principal components and their contribution to total variance

以3個PC對應的方差相對貢獻率為權重，將各品種PC得分和相應的權重進行線性加權求和建立綜合評價函數F=0.506F1+0.276F2+0.218F3，計算各品種蓮藕的綜合評價得分以反映其氨基酸綜合品質，綜合得分越高說明該品種蓮藕氨基酸營養品質越好。如表6所示，綜合得分排名前5的品種依次為‘金華無籽藕’（L01）、‘細卜’（L08）、‘鄂蓮5號’（L03）、‘武義白姆食用藕’（L21）、‘金華紅蓮’（L10），說明這5個蓮藕品種的氨基酸綜合品質相對較好。

表6 不同蓮藕品種的成分得分和綜合得分Table 6 Principal component scores and comprehensive scores of different cultivars of lotus rhizomes

續表6

2.6 不同品種蓮藕游離氨基酸的聚類分析

對28個品種蓮藕中17種氨基酸含量進行聚類分析，結果如圖3所示，所有蓮藕品種可分為3 類：第1類為L01（‘金華無籽藕’）、L08（‘細卜’）、L03（‘鄂蓮5號’）和L21（‘武義白姆食用藕’），這4種蓮藕的TAA含量、鮮味氨基酸及芳香味氨基酸含量均高于平均值，口感最好；第2類包括L04（‘金藕4號’）、L05（‘金藕2號’）、L14（‘武義柳城食用’）、L19（‘鄂蓮9號’）、L15（‘湖州早白荷’）和L20（‘金藕3號’），這6種蓮藕的TAA含量、鮮味氨基酸及芳香族氨基酸含量均低于平均值，品質最差；第3類為L27（‘江蘇無花藕’）、L10（‘金華紅蓮’）、L25（‘馬口白蓮’）、L09（‘紅花藕’）、L22（‘湖州中白荷’）、L18（‘杭州藕’）、L02（‘金藕1號’）、L13（‘鄂蓮6號’）、L16（‘鄂蓮1號’）、L17（‘蘇州食用藕’）、L26（‘東河早藕’）、L12（‘金華白蓮’）、L07（‘武義食用藕’）、L11（‘鄂蓮7號’）、L06（‘鄂蓮新品系’）、L28（‘金華小花食用藕’）、L23（‘粗卜’）和L24（‘紹興紅花藕’），這一類蓮藕的TAA含量、鮮味氨基酸及芳香味氨基酸含量接近平均值，品質較好。聚類結果與前述PCA結果一致。因此，可為蓮藕品種的引種推廣、開發利用及氨基酸營養價值評價提供良好參考。

圖3 不同品種蓮藕聚類分析圖Fig. 3 Dendrogram from cluster analysis of different lotus rhizomes

3 結 論

本研究對28個不同品種蓮藕進行游離氨基酸含量、組分和呈味特性分析，結果表明，不同品種蓮藕均含有17種游離氨基酸，TAA含量為10.82～17.84 mg/g，平均含量約為14.33 mg/g。蓮藕中呈味氨基酸含量從高到低依次為鮮味氨基酸、苦味氨基酸、芳香族氨基酸與甜味氨基酸，其中鮮味氨基酸含量約占TAA含量的69%。蓮藕氨基酸含量與呈味氨基酸構成均存在顯著的品種差異性。PCA與聚類分析結果表明，3個PC累積貢獻率達到80.16%，28個蓮藕品種可分為3 類。篩選獲得‘金華無籽藕’‘細卜’‘鄂蓮5號’‘武義白姆食用藕’‘金華紅蓮’5個游離氨基酸品質較好的蓮藕品種。本研究結果為今后利用不同蓮藕種質，基于蓮藕氨基酸含量開發藕制品，以及蓮藕的營養與特征風味研究和品種選育等提供理論依據。