超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜鑒定核桃仁的脂質構成

支虎明，王星蘇，趙佳佳，喬 玲，武棒棒，鄭興衛，閆素仙,*，鄭 軍,*

（1.山西農業大學小麥研究所，山西 臨汾 041000；2.山西師范大學食品科學學院，山西 臨汾 041000）

核桃（Juglans regiaL.）屬于胡桃科胡桃屬，含油量約為52%～70%，是我國重要的經濟樹種。我國種植核桃已有2000多年的歷史，是核桃屬植物的發源地。2019年我國核桃總產量達158.6萬 t，占世界總產量的43.31%[1]。由于核桃仁含有豐富的營養可直接鮮食或干制食用，還能加工成核桃粉、核桃乳、核桃酥糖和椒鹽核桃等食品。核桃仁還是食用油的良好來源，不僅可用于烹飪，而且因亞麻酸含量高和干燥快，還可用作油漆和充當化妝品成分[2]。核桃仁中的油脂含有大量亞油酸（C18:2）和亞麻酸（C18:3）等人體必需的不飽和脂肪酸，這些脂肪酸能降低人血清中膽固醇和甘油三酯（triacylglycerol，TG）的含量，有效防止動脈硬化、冠心病、膽固醇和糖尿病等疾病的發生[3]；核桃仁中n-3與n-6不飽和脂肪酸的比例有利于人類健康，是理想的保健食品[4]。此外，核桃仁中的磷脂能延緩大腦細胞衰老，抑制腫瘤生長[5]。因此大力開發核桃仁的功能產品和保健作用，可以改善人們的膳食營養和健康水平。

關于核桃仁脂質成分研究較少，脂質組分不明確已成為核桃優良品種選育和功能食品開發的主要限制因素。馮春燕[6]、余啟明[7]等利用氣相色譜對云南、陜西和北京等不同地區核桃仁的脂肪酸進行比較，發現脂肪酸組成基本一致，但品種間脂肪酸含量差異明顯。山西不同地區10種核桃油的脂肪酸和生育酚組成差異也較大，且油酸含量的變異系數最大[8]。在開心果、腰果、花生、山核桃、杏仁和核桃6種堅果的磷脂成分中，核桃占據了96種，含量和種類都多于其他堅果[9]。進一步針對核桃油、香油、荸薺油、榛子油和山毛櫸油的TG進行檢測，發現核桃油以TG(54:6-8)為主[10]。目前有關核桃的脂質成分研究，多采用色譜法或聯合其他分離方法鑒定脂肪酸、磷脂和甘油酯等單一脂質的組成和含量，對核桃全脂質組成的系統研究鮮見報道。

由于脂質化學成分的多樣性和復雜性，國際脂質分類和命名委員會提出了較為權威的分類方法，將脂質分為脂肪酸類（fatty acid，FA）、甘油脂、磷脂類、鞘脂類、糖脂類、固醇脂類、孕烯醇酮脂類和多聚乙烯類共8 大類[11]。脂質組學是基于高通量分析技術，系統解析生物體內脂質組成與表達的研究方法，可高效分析鑒定脂質家族及其代謝物[12]。脂質組學可以全面鑒定食品中8 大類脂質的含量，進而了解相關成分在代謝調控中的作用，為現代食品科技發展提供一個嶄新的視角。超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜（ultra-high performance liquid chromatography coupled to orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Orbitrap HRMS）可以將脂質分子高效分離后準確定性，是目前脂質組中檢測最高效的方法，具有靈敏度高和分辨率好的優點。衛海蓮等[13]利用UPLC-TOF-MS/MS快速準確地分析出青刺果油的脂質組成、種類及相對含量。將UPLC-HRMS應用于花生、大豆等5種油料作物脂質成分的比較研究，共鑒定出132種脂質分子[14]?；赨PLC結合Orbitrap質譜儀的分析平臺，Karen等[15]分析了6種微藻的脂質組，得到了102種TG。Lu Shaoping等[16]在油菜不同組織中，共檢測出13種脂質亞類，218種甘油酯，甚至檢測到很多低豐度的脂質分子。此外，白菜葉片中成功鑒定出232種脂質，包含104種磷脂、63種糖脂和65種甘油酯[17]?？梢奤PLC-Orbitrap HRMS的應用日趨成熟，為植物脂質代謝研究提供了可靠的分析平臺。核桃是我國最主要的油料堅果，核桃仁脂質組分是影響其生長發育、口味、營養品質和功能的重要因素，關于核桃仁脂質組全面分析的研究鮮見報道。本實驗采用UPLC-Orbitrap HRMS對核桃仁脂質組成進行定性和定量分析，以期為研究核桃功能性脂質成分，提升核桃營養品質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香核桃，1983年由河北農業大學從日本引進，因其適應性強、果大仁滿，在山西、新疆、河北、山東和湖北等省份大面積種植，是我國種植面積最大的 品種[18-19]。核桃樣品采集于山西農業大學小麥研究所隰縣試驗站（東經110°57′，北緯36°42′，海拔1 100 m，年平均降水量570 mm，年平均氣溫9.5 ℃），在產量穩定的果園中選取正常發育的植株；10月中旬收獲后，去青皮，清洗后于32 ℃烘10 h，37 ℃烘24 h去除70%水分，35 ℃烘15 h后備用。

乙腈、異丙醇、甲醇、甲基叔丁基醚（均為分析純） 美國Thermo Fisher公司；SPLASH LIPIDOMIX同位素內標：1-十五烷酰基-2-油酰基磷脂酰絲氨酸、 1-十五烷?；?2-油?；字Ｒ掖及?、1-十五烷酰基-2-油?；字Ｄ憠A、1-十五烷?；?2-油?；字８视?、1-十五烷?；?2-油?；字＜〈?、1-十五烷酰基-2-油?；字?、1-油?；?2-羥基磷脂酰膽堿、1-油酰基-2-羥基磷脂酰肌醇、1-十五烷?；?2-油?；视投ァ?,3-二十五烷?；?2-油酰基甘油三酯、膽固醇酯、N-油?；?D-赤型-鞘脂類磷脂酰膽堿、N-十六烷?；淝拾贝?美國Avanti公司。

1.2 儀器與設備

Nexera LC-30A UPLC儀 日本島津有限公司；Q-Exactive質譜儀 美國Thermo Scientific公司；5430R高速冷凍離心機 美國Eppendorf公司；Acquity UPLC CSH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Water公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選出來自不同果樹的光滑飽滿，大小一致的果仁10 份。將樣品用液氮磨成粉狀，將10 份材料混勻，每次上樣取30 mg加入200 μL水和20 μL內標溶液，混勻后加入800 μL甲基叔丁基醚，渦旋混合，最后加240 μL預冷甲醇渦旋混合。低溫水浴中超聲20 min，室溫放置30 min，10 ℃、14 000×g離心15 min取上層有機相，氮氣吹干；加入200 μL 90%異丙醇-乙腈溶液復溶，充分渦旋，取90 μL復溶液，10 ℃、14 000×g離心15 min，取3 μL上清液進樣分析。連續檢測5 次。

1.3.2 色譜條件

采用超高效液相色譜系統進行分離，C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；柱溫45 ℃；流速300 μL/min。流動相A：乙腈溶液（乙腈-水，6∶4，V/V）；流動相B：乙腈-異丙醇溶液（乙腈-異丙醇，1∶9，V/V）。梯度洗脫步驟：0～2 min，70% A，30% B；2～25 min， 70%～0% A，30%～100% B；25～35 min，70% A，30% B。整個分析過程中樣品置于10 ℃自動進樣器中。

1.3.3 質譜條件

樣品經UPLC分離后用Q Exactive質譜儀進行質譜分析，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子和負離子模式進行檢測。ESI條件如下：鞘氣流速45 arb；輔助氣流速15 arb；碰撞氣流速1 arb；噴霧電壓3.0 kV；毛細管溫度350 ℃；霧化溫度300 ℃；透鏡電壓水平為50%；MS1掃描范圍m/z200～1 800。脂質分子和脂質碎片的質荷比通過每次全掃描后采集10個碎片圖譜（MS2scan）得到；MS1在m/z200時分辨率為70 000，MS2在m/z200時分辨率為17 500。

1.4 數據處理

采用同位素內標法，利用待測物與內標的響應豐度比值（峰面積比）以及內標的濃度，計算待測物的絕對含量。利用AnalystR TF 1.6和Multi QuantTM軟件獲得數據，采用Lipid Search對脂質分子及內標脂質分子進行峰識別、峰提取和脂質鑒定等處理，形成內部數據。主要參數：前體容許偏差5×10-6，產物容許偏差5×10-6，產物離子閾值5%。對脂類分子種類進行鑒定，主要根據保留時間、m/z和碎片離子模式；提取得到的數據，進行數量統計和脂質組成分析。采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.5繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 色譜保留行為

同一種類脂質分子的洗脫順序由脂肪酸鏈碳原子數和雙鍵數決定。一般情況下，碳原子數多則保留時間長，洗脫較慢；雙鍵數越多則保留時間短，洗脫快。在25 min左右樣品峰基本檢測完成，脂質分子峰形較好、分離度和響應值好。5 次上樣的色譜圖進行比較，樣本的色譜峰響應強度和保留時間基本重疊（圖1），說明實驗重復性和穩定性較好。

圖1 在正離子（a）、負離子（b）模式下色譜圖Fig. 1 Chromatograms in ESI positive (a) and negative ion modes (b)

2.2 脂質鑒定結果

脂質分子碰撞誘導解離導致不同結構位點的化學鍵斷裂，產生特異性離子或中性丟失碎片離子。在正、負離子模式下，分別對樣品進行掃描，確定準分子離子，優化毛細管電壓等參數，使特征碎片離子峰強度最大，選擇豐度較高的2個分子離子作為定性離子，豐度最高的作為定量離子。在正離子模式下，TG、甘油二酯（diacylglycerol，DG），部分磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）和溶血性磷脂酰膽堿（lyso-posphatidyl choline，LPC）質譜響應強度較好（圖2a）。TG、DG電離形成[M+NH4]+，PC、PE和LPC產生[M+H]+。在負離子模式下，磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol，PI）、磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl serine，PS）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol diphosphate，PIP）、雙磷脂酰甘油（cardiolipin，CL）、溶血性磷脂酰乙醇胺（lysoposphatidyl ethanolamine，LPE）、溶血性磷脂酰甘油（lyso-phosphatidylglycerol，LPG）、溶血性磷脂酰肌醇（lyso-phosphatidyl inositol，LPI），部分PE、PC和糖脂質譜有較好的響應（圖2b）。PI、PA、PS、PG、PIP、PE、CL、LPE、LPG、LPI電離形成[M+H]-，PC和糖脂產生[M+HCOO]-。

圖2 在正離子（a）和負離子（b）模式下色譜圖Fig. 2 Chromatograms in ESI positive (a) and negative ion modes (b)

參考Lipid Maps（https://www.lipidmaps.org/）和Lipid Bank（http://www. lipidbank.jp/）脂質數據庫，結合脂質分子在正、負離子模式下色譜圖的保留時間、一級質譜圖和二級質譜圖的數據，可鑒別核桃仁中的脂質分子，以TG(54:7)、PC(34:2)和PA(35:2)為例解析質譜行為。

TG(54:7)在正離子模式下其主要的質譜峰為[M+NH4]+（m/z894.754 5）。TG的二級質譜，產生碎片離子m/z597.488 1、597.503 8和337.274 6，對應[FA(18:2)-H+NH4]+、NL[FA(18:3)-H+NH4]+和MG(18:2)-OH，經解離產生特征碎片離子m/z263.236 8和m/z261.221 2（圖3a），對應脂肪酸C18:2和C18:3，可鑒定為TG(18:2/18:2/18:3)。

PC(34:2)在負離子模式下產生[M-H]-（m/z802.560 360 5），二級質譜圖主要產生m/z742.537 77、279.233 5和255.233 5的碎片離子，依次對應于[M-CH3]-PC頭部甲基丟失、斷裂的脂肪酸C18:2和C16:0（圖3b），分子結構鑒定為PC(16:0/18:2)。

PA(35:2)在負離子模式下產生母離子[M-H]-（m/z685.481 381 5），二級質譜產生m/z405.242的離子碎片，鑒定為[LPA(17:0)-H2O-H]-，經碰撞誘導解離，產生碎片離子m/z279.233 5和m/z269.249 1，對應脂肪酸C18:2和C17:0（圖3c），鑒定為PA(17:0/18:2)。

2.3 核桃仁中脂質種類

核桃仁中鑒定到脂質亞類共20種，脂質分子525種。不同亞類的脂質分子數量差異很大（圖4），共檢測到甘油脂有250種，其中TG的數量最多，共有207種，DG有43種；221種磷脂包括50種PC、31種PA、36種PE、35種PS、19種PI、14種PG、12種LPC、5種LPE、2種LPG、2種LPI、5種PIP和10種CL；鞘脂類共36種，包括28種神經酰胺（ceramides，Cer），7種CerG1，1種鞘磷脂（sphingomyelin，SM）；18種糖脂，包括3種單半乳糖甘油二酯（monogalactosyldiacylglycerol，MGDG），9種雙半乳糖甘油二酯（digalactosyl-diacylglycerol，DGDG），6種硫代異鼠李糖甘油二酯（sulfoquinovosyl-diacylglycerol，SQDG）。

此外，在核桃仁中脂肪酸的種類豐富，包括21種飽和脂肪酸，分別為C4:0、C8:0、C10:0、C12:0、C13:0、C15:0、C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、C19:0、C20:0、C21:0、C22:0、C23:0、C24:0、C25:0、C26:0、C27:0、C29:0、C30:0；27種不飽和脂肪酸：C10:1、C10:2、C12:1、C14:1、C14:2、C14:3、C16:1、C17:1、C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C19:1、C20:1、C21:1、C20:2、C20:4、C20:5、C22:4、C22:5、C22:6、C24:1、C24:2、C26:1、C28:1、C29:1、C30:1。檢測出較低含量的稀有中鏈脂肪酸C4:0、C8:0、C10:0、C10:1、C10:2和超長鏈脂肪酸C24:2、C25:0、C26:0、C27:0、C26:1、C28:1、C29:1、C30:1。核桃仁中長鏈不飽和脂肪酸的存在意味著特殊脂肪脫氫酶或延長酶的存在，負責甘油酯鏈的不飽和及延長[20]。

鄭殊寧等[17]在大白菜中鑒定出14種脂質亞類，共232種脂質分子；Song Shuang等[9]在核桃中鑒定出10種磷脂亞類，共96種磷脂分子；在青刺果油中鑒定出14個脂質亞類，169種脂質分子[13]。本實驗利用UPLCOrbitrap HRMS在核桃中測出20種亞類共計525種脂質分子，其中磷脂亞類12種，磷脂分子221種，還測出了135個痕量脂質分子，數量遠高于之前的報道。

2.4 脂質各亞類含量

核桃仁中脂質含量為145 523.45 μg/g，甘油脂含量最高，以DG和TG為主，分別占總脂質的45.23%和41.77%；磷脂的種類最多，包括PA、PG、PS、PC、PE、LPC、PI、LPG、LPI、LPE、PIP和CL共12種，占總脂質的12.97%；糖脂占到0.02%，含量較少；鞘脂類只有0.01%。

2.4.1 核桃仁中甘油脂組成

核桃仁中共鑒定出207種TG，含量最高的是TG(18:2/18:2/18:3)（二亞油酸亞麻酸甘油三酯，LLLn），約占總脂質的15.65%；其次是TG(18:1/18:1/18:1)（三油酸甘油三酯，OOO）、TG(18:2/18:3/18:3)（二亞麻酸亞油酸甘油三酯，LnLnL）、TG(18:1/18:2/18:3)（亞麻酸亞油酸油酸甘油三酯，OLLn），分別占4.50%、4.33%和3.05%。核桃仁中TG(54:3-7)最多，主要由亞油酸、亞麻酸和油酸組成，占總脂質的27.53%（表1）。43種DG中含量最高的是DG(18:2/18:2)，其次是DG(18:1/18:2)、DG(16:0/18:2)、DG(18:2/18:3)、DG(18:1/18:1)，分別占19.69%、7.36%、7.52%、4.30%和3.65%。

表1 核桃仁中含量較高的30種TG分子Table 1 Analysis of 30 major TGs in walnut kernel

植物油脂合成路徑中甘油-3-磷酸以脂酰輔酶A為供體，在甘油三磷酸酰基轉移酶催化下生成LPA；LPA在LPA?；D移酶催化下形成PA，PA去磷酸化產生DG。種子油脂積累過程中DG在DAG?；D移酶?；纬蒚G，TG與油體蛋白形成油脂[21]。分析TG和DG分子結構，發現TG均含有類似的DG碳骨架分子，且主要以18:2/18:2、18:1/18:2、18:2/16:0、18:2/18:3、18:1/18:1為主，可能是從頭合成的脂肪酸主要是棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和油酸（C18:1），油酸（C18:1）去飽和形成亞油酸（C18:2）、亞麻酸（C18:3）[22]。 TG(18:2/18:2/18:3)由DG(18:2/18:2)?；纬桑颂胰手蠺G(18:2/18:2/18:3)相對含量為15.64%，DG(18:2/18:2)的相對含量較高為19.69%，可見調節DG形成TG的代謝途徑，是進一步提高油脂產量的有效方法。

已有研究表明TG在植物油脂中含量最高，在不同的堅果油中富含的TG分子不同。香油主要以TG(54:3-6) 為主，荸薺油以TG(54:2-3)為主，榛子油TG(54:3)與TG(52:2)含量高而山毛櫸油以TG(54:5)居多，核桃油的TG(54:6-8)最多，占總脂質的38.9%，是其他堅果油的2 倍[10]。本實驗檢測到核桃仁中以TG(54:6-8)最多，占總脂質的23.03%，核桃中TG的不飽和程度遠高于其他堅果，直接影響核桃的品質和營養價值。

核桃仁大部分TG分子含有的碳原子數集中在50～56之間，屬于中鏈。中鏈脂肪酸甘油三酯容易被人體分解吸收[23]，這可能是核桃仁脂質組成有利于人體健康的原因之一。核桃仁TG中雙鍵數為7的分子最多，說明TG中含有大量的不飽和脂肪酸（圖4）。有研究證明，用核桃取代飲食中的不飽和脂肪酸，可有效降低高血脂患者膽固醇水平和低密度脂蛋白，核桃中不飽和脂肪酸可促進低密度脂蛋白的氧化，氧化的低密度脂蛋白在動脈粥樣硬化中可發揮重要作用[24]。核桃TG中的不飽和脂肪酸以亞油酸（C18:2）含量最高，其次為亞麻酸、油酸。亞油酸氧化會產生正丁醛、2-丁烯醛、戊烯醛以及己烯醛等揮發性成分，已有研究表明這類物質決定核桃仁的風味和口感[25]。亞麻酸在人體中會轉化成二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸是神經組織膜磷脂的重要組成，在神經保護、腦動脈血管擴張和神經可塑性等方面起重要 作用[26]。因此，長期適當補充核桃仁能改善老年人的認知障礙，提高學習記憶能力。

圖4 TG分子的鏈長度（a）和鏈不飽和度（b）Fig. 4 Chain length (a) and unsaturation (b) of TGs

2.4.2 核桃仁中磷脂組成

核桃仁中含有較豐富的磷脂，約占總脂質的12.97%，包括PA、PG、PS、PC、PE、LPC、PI、LPE、CL、PIP、LPI和LPG。其中PA、PG、PS、PC和PE分別占磷脂的43.88%、22.85%、11.32%、10.64%和6.16%，其他為5.15%（圖5）。含量較多的磷脂分子：PA(17:0/18:2)、PA(17:0/18:1)、PA(18:2/18:2)、PA(19:1/18:1)和PG(44:0)（表2）。DG(18:2/18:2)含量約占19.69%，而目前檢測到的PA(18:2/18:2)僅有0.59%，說明PA作為前體轉化生成了DG。PA、PG、PI、PE、PC這5種磷脂均含有相同的DG碳骨架分子16:0/18:1、16:0/18:2和16:0/18:3，已證明PC和PG分子可作為sn-2位C18脂肪酸去飽和的載體[27]。Song Shuang等[9]比較6種堅果的磷脂成分，測得核桃磷脂含量依次為PI、PE、PC、PA、PG、LPC、PS和LPE，沒有SM，與實驗結果不同，可能是由于Song Shuang等[9]的測試樣品來源不清造成的差異。

表2 核桃仁中含量較高（≥0.1%）的19種磷脂分子Table 2 Analysis of 19 phospholipids with higher contents (≥0.1%) in walnut kernel

本實驗檢測到核桃仁中磷脂種類較為豐富。PA可作為磷脂、糖脂和甘油酯形成的共同底物，還可作為信號分子，參與細胞生長和分化、信號接收和轉導等過程，在代謝調節過程中具有重要作用[28]。PC是組成細胞膜脂蛋白的重要成分，也是膽堿合成的重要前體，膽堿通過血液循環進入大腦，可與乙酰輔酶A合成乙酰膽堿，促進大腦的神經細胞興奮[29]。PI不僅是膜脂成分，也是與信號轉導和細胞周期相關的多磷酸肌醇磷脂的前體。PS中含有氨基，協同VE發揮抗氧化作用。PE、PG在膜脂中含量豐富，具有抗氧化作用的生物活性脂類[30]。LPC、LPE等溶血磷脂不僅可作為生物膜磷脂的代謝物，還是細胞內的信號分子，參與調控細胞增殖、腫瘤細胞侵染和創傷愈合等廣泛的細胞活動[31]。因此，建議多食用核桃及核桃制品以補充人體磷脂攝入量。

2.4.3 核桃仁中糖脂組成

核桃仁中糖脂含量相對較低，僅占總脂質的0.02%。如圖5所示，DGDG是主要成分，含量為26.8 μg/g。DGDG中含量較多的是DGDG(18:2/18:2)、DGDG(18:2/18:3)和DGDG(16:0/18:2)。MGDG含量為6.2 μg/g，SQDG為1.6 μg/g。糖脂是核桃仁中構成膜脂的主要成分，含量較少。甘油糖脂還具有多種藥理學功能，如抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等[32]。

圖5 磷脂（a）和糖脂（b）各亞類含量Fig. 5 Contents of GP (a) and SL (b) subclasses

2.4.4 核桃仁中鞘脂類組成

核桃仁中Cer和SM僅占到總脂質的0.01%。Cer含量為10.5 μg/g，共鑒定出35種分子，Cer(d32:0)和Cer(d34:0)的含量較多。這類物質作為細胞的第二信號分子，可以促進細胞的增殖，凋亡和生長停滯，還可以抑制腫瘤的發生和轉移并增加腫瘤對化療藥物的敏感性[33]。此外，首次檢測到核桃仁脂質中存在1種SM(d22:1)，這類物質在其他油料作物中尚未有報道。

3 結 論

采用UPLC-Orbitrap HRMS技術系統分析了核桃仁的脂質組成，共鑒定出525種脂質分子，包含250種甘油酯、221種磷脂、18種糖脂和36種鞘脂類。甘油酯包括DG（45.23%）和TG（41.77%）。TG分子中TG(18:2/18:2/18:3)含量最高，DG分子中DG(18:2/18:2)含量最高。DG和TG中的脂肪酸鏈主要由亞油酸、亞麻酸等人體必需脂肪酸組成。磷脂占總脂質的12.97%，種類較為豐富，其中PA含量最高，約為總磷脂的43.88%。本實驗構建的核桃脂質圖譜對核桃脂質代謝和功能開發的研究具有重要理論和應用價值。