快速濾過型凈化結合液相色譜-質譜聯用法測定茶葉中特丁硫磷及其5種代謝產物

劉松南，田 旭，高 晶，蘭 韜，李 曼，李延梅，趙 焱，董曉倩,*，潘燦平

（1.北京食品科學研究院北京市茶葉質量監督檢驗站，北京 100162；2.中國計量科學研究院，北京 100029；3.中國標準化研究院，北京 100191；4.中國農業大學理學院，北京 100193）

特丁硫磷，又名特丁磷，是一種高效、廣譜有機磷殺蟲劑，主要用于防治土壤線蟲和地下害蟲[1]。特丁硫磷在動物和植物體內代謝生成特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON 5種代謝產物[2-3]。因特丁硫磷對人體存在潛在危害，很多國家都制定了嚴格的殘留限量。其中，歐盟規定特丁硫磷在食品中的最大殘留限量均為0.01 mg/kg，日本在“食品中農業化學品殘留肯定列表制度”中規定茶葉中特丁硫磷最大殘留限量為0.005 mg/kg。在我國，農業部第1586號公告明確規定禁止特丁硫磷在茶樹上使用，GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》[4]中規定茶葉中特丁硫磷最大殘留限量（以特丁硫磷及其代謝物亞砜和砜之和計）為0.01 mg/kg，但是并未指定檢測方法標準。特丁硫磷有限量要求卻沒有國家標準檢測方法的情況導致了在監管層面無法執法。有研究表明某些特丁硫磷代謝產物具有更強的移動性和環境持久性，如特丁硫磷砜和特丁硫磷亞砜在天然水和蒸餾水的半衰期分別為18～40 d和280～350 d，遠長于特丁硫磷天然水和蒸餾水中的半衰期（3～3.5 d）[5]。而特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON的毒理學相關數據較少，其環境風險及對人類危害程度尚不可知，因此更加需要加大對該3種代謝產物的研究和關注。

在現行有效的國家檢測標準中，多數只針對特丁硫磷及其中1種或者2種代謝產物進行檢測[6-8]，最新發布的GB 23200.121—2021《植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》[9]中也只檢測了特丁硫磷、特丁硫磷亞砜及特丁硫磷砜3種化合物。由于國內外對特丁硫磷的代謝產物研究較少，特別是對特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON三種代謝產物的關注不夠，因此尚未有對這3種重要代謝產物的檢測方法標準。國內外關于特丁硫磷及其代謝產物的檢測多數僅限于對特丁硫磷的檢測，檢測手段多為氣相色譜法、液相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法[10-13]。僅有少部分研究采用液相色譜-串聯質譜法檢測了特丁硫磷、特丁硫磷亞砜及特丁硫磷砜。劉佳等[14]采用液相色譜-質譜聯用法同時檢測了果蔬中該3種化合物的殘留量，該方法提取后直接上機檢測，未對提取液進行凈化，并不適用于茶葉這種復雜樣品基質。陳泳等[15]的方法也只檢測了植物源性食品中特丁硫磷、砜及亞砜3種物質。目前鮮見對特丁硫磷及其5種代謝產物同時檢測的研究報道。

快速濾過型凈化（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）技術是根據固相萃取凈化原理，在QuEChERS凈化基礎上進一步簡化形成的一種快速新型的凈化手段。該技術是通過篩板將凈化劑預先固定于注射器中，然后將待凈化樣品提取液加入注射器中，通過單次或反復推拉注射器活塞即完成凈化過程，操作簡便，凈化速度快，前處理效率高，目前已經應用于水果、蔬菜、茶葉等中農藥的檢測[16-19]。

本實驗擬結合m-PFC前處理技術，建立液相色譜-質譜聯用法同時檢測茶葉中特丁硫磷及其5種代謝產物殘留的方法，彌補現有方法的不足，以期更為準確地評估茶葉中特丁硫磷及其代謝物總量的真實殘留水平，同時為研究特丁硫磷在茶葉上的代謝過程提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉（紅茶、綠茶、普洱茶） 市購。

特丁硫磷、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜標準物質（100 μg/mL） 天津阿爾塔科技有限公司；特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON、特丁硫磷砜-OXON（100 μg/mL） 德國Dr. Ehrensorfer公司。

乙腈、甲醇（均為色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純），30%過氧化氫溶液 國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）（40～60 μm）、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）（10～20 nm）、m-PFC凈化柱管 北京科德諾思技術有限公司。實驗用水由Milli-Q純水機（0.22 μm過濾膜，美國Millipore公司）制得。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Ultra EMR液相色譜-串聯質譜聯用儀（配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）） 賽默飛世爾（中國）科技有限公司；AEL200分析天平（感量0.1 mg） 日本島津公司；JJ500電子天平（感量0.01 g） 常熟雙杰測試儀器廠；LD5-2B離心機 北京京立離心機有限公司；KDC-140HR離心機（配有2 mL轉頭） 安徽中科中佳公司；MVS-1渦旋混勻器 北京金紫光公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

空白基質溶液：稱取空白茶葉（經測定不含待測農藥）樣品進行提取、m-PFC凈化，收集凈化液，于4 ℃冰箱冷藏保存。

混合標準貯備溶液：準確吸取質量濃度為100 μg/mL的各標準溶液母液0.200 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，配制成質量濃度為2.00 μg/mL的混合標準貯備溶液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為1個月。

混合標準工作溶液：準確吸取混合標準貯備溶液0.005、0.025、0.050、0.250、0.50、1.00、2.50 mL分別置于10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容，配制為質量濃度為1、5、10、50、100、200、500 μg/L的系列混合標準工作液，現用現配。

基質混合標準工作溶液：準確吸取混合標準貯備溶液0.005、0.025、0.050、0.250、0.50、1.00、2.50 mL分別置于10 mL容量瓶中，用空白基質溶液定容，配制為質量濃度為1、5、10、50、100、200、500 μg/L且稀釋液濃度為50%乙腈的系列基質混合標準工作液，現用現配。

含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液（5 mmol/L）：稱取0.385 4 g乙酸銨，用體積分數0.1%甲酸溶液溶解并稀釋至1 000 mL，搖勻。

1.3.2 提取

取茶葉樣品經粉碎機粉碎，過80 目篩，裝袋， -18 ℃避光保存，備用。

稱取上述茶葉粉末1 g（精確至0.001 g）于10 mL塑料離心管中，加入2.00 mL水充分混勻后，靜置10 min，再加入5.00 mL乙腈充分混勻，旋渦振蕩提取1 min，浸泡提取10 min，再次旋渦振蕩1 min，加入2 g氯化鈉旋渦振蕩1 min，6 000 r/min離心3 min，收集上清液，待凈化。

1.3.3 凈化

取前述提取液1.00 mL，移入m-PFC小柱上端，緩慢推動注射桿，控制流出速率1 滴/s，收集流出液。準確吸取0.500 mL凈化液于2 mL離心管中，加入0.500 mL水，混勻，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾，上機分析。實驗流程如圖1所示。

圖1 實驗流程圖Fig. 1 Flow chart of m-PFC combined with LC-MS/MS

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18（2.1 mm×100 mm，3 μm），配備相應保護柱；柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流動相：A為含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液，B為含0.1%甲酸的甲醇混合溶液；流速0.30 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4.2 質譜條件

毛細管電壓4 000 V，氣化溫度300 ℃，鞘氣流速15 mL/min，輔助氣流速15 mL/min，離子傳輸管溫度320 ℃，碰撞氣壓力2.0×10-4kPa。電離模式：ESI+，選擇反應模式監測，其他參數見表2。

表2 質譜檢測參數Table 2 Mass spectrometric parameters

1.4 數據處理

圖譜采集及數據定量分析采用Thermo Xcalibur數據處理系統進行，圖像處理采用Origin 8.0進行。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

目前采用液相色譜-質譜聯用法檢測農藥時使用最為廣泛的流動相為乙腈-水體系，本研究首先采用乙腈-水（含0.1%甲酸）體系作為流動相進行實驗，結果發現在該體系下特丁硫磷的靈敏度很低，無法達到檢測要求。陳泳等[15]研究發現當采用甲醇-乙酸銨體系時，特丁硫磷、特丁硫磷亞砜及特丁硫磷砜3種化合物可以達到檢測要求。本實驗采用含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液以及含0.1%甲酸的甲醇混合溶液體系作為流動相，同時優化洗脫梯度，進行特丁硫磷及其5種代謝產物的檢測，發現特丁硫磷的峰強度得到了明顯改善，6種化合物靈敏度高、出峰時間穩定，滿足定性、定量分析。因此，采用含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液和含0.1%甲酸的甲醇混合溶液體系作為流動相進行后續實驗。特丁硫磷及其5種代謝產物的提取離子流圖見圖2。

圖2 特丁硫磷及其代謝產物的提取離子流圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of terbufos and its metabolites

2.2 提取溶劑的選擇

目前用于農藥提取的溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。與其他溶劑相比，乙腈具有很好的破壁作用，能夠沉淀提取液中的蛋白質和脂肪等雜質，提高農藥的回收率。本實驗室前期研究表明采用乙腈作為提取溶劑時，提取液中的干擾組分最少[20]，因此采用乙腈作為提取溶劑。

在植物源食品的農藥提取過程中，除了有機溶劑外，加入一定量的水能夠增加樣品細胞的通透性，從而提高樣品中農藥的析出[21]。雖然有文獻報道稱不加水進行提取亦能獲得較好的回收率[22]，但是其采用的是后加標的方法進行評價，所添加的農藥均在樣品表面或是直接在提取溶液中，難以模擬真實樣品中農藥從茶葉細胞內部提取出來的過程。特丁硫磷及其5種代謝產物均為極性化合物，研究表明檢測極性農藥時采用加水浸泡的預處理方式能夠提高農藥的回收率[23]，因此本實驗首先加水使茶葉充分浸潤。

因提取溶劑含水，需要加入無機鹽使水和乙腈分層，并通過鹽析作用使農藥分配于乙腈層。傳統的QuEChERS法中通常會添加無水硫酸鎂和氯化鈉作為提取添加劑，但無水硫酸鎂遇水容易結塊并釋放大量的熱，會導致特丁硫磷等農藥發生分解，影響其回收率，因此本實驗在提取過程中只選取氯化鈉一種無機鹽作為提取添加劑。研究表明，氯化鈉溶液在氯化鈉濃度達到飽和時，乙腈-水體系的分層效果最好[24-25]，本實驗直接選用飽和氯化鈉溶液進行后續研究。

鹽析分層后，富乙腈相的體積直接影響農藥的回收率。研究表明富乙腈相的獲得率（分層后富乙腈相的體積與初始加入乙腈的體積比）和初始加入的乙腈與水的體積比有關[26]，因此考察乙腈和飽和氯化鈉溶液在不同比例混合分層后，富乙腈相的獲得率。

將乙腈與飽和氯化鈉溶液按照3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2的體積比混合均勻于刻度離心管中，溶液總體積為10 mL，經離心溶液分層為富乙腈相（上層）和富水相（下層）。結果發現當采用3 mL乙腈與7 mL氯化鈉飽和溶液進行分層實驗時，富乙腈相只有1.9 mL（乙腈獲得率63.3%）。隨乙腈比例的增加，乙腈獲得率逐漸增大，即逐漸接近初始加入乙腈的體積（圖3）。當乙腈與飽和氯化鈉溶液體積比為7∶3時，富乙腈相比例為97.1%。繼續降低飽和氯化鈉（水）的比例，將無法全部浸透部分比重較輕的茶葉。根據此結論，選擇加入2 mL水浸泡茶葉，然后加入5 mL乙腈進行提取，后加入2 g氯化鈉確保充分飽和進行鹽析分層。

圖3 乙腈與飽和氯化鈉溶液按照不同比例混合時乙腈獲得率Fig. 3 Effect of ratio between acetonitrile and saturated sodium chloride solution on the yield of acetonitrile phase

2.3 吸附劑材料的選擇

茶葉中含有大量的脂肪酸、色素、多酚以及生物堿類[27]，如果不進行充分凈化不僅會干擾目標化合物的檢測而且還會污染色譜柱和質譜系統。目前常用的雜質吸附劑材料主要有石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、MWCNTs、C18、PSA等[28-29]。GCB和MWCNTs對茶葉提取液中的色素有很強的吸附能力[30-31]。PSA具有弱陰離子交換能力，可通過氫鍵作用吸附小分子化合物如脂肪酸、有機酸、糖類、花青素等[32]，還對酯型結構和多酚類物質具有很強的吸附作用[33-34]。C18對非極性組分有吸附作用，能夠通過非極性相互作用吸附弱極性的脂肪酸、甾類、色素、油脂等大分子物質。研究表明MWCNTs比GCB有更大的比表面積，吸附色素的能力更強[30]，C18對于茶葉中多酚、色素等雜質的去除效果不明顯[33-35]，因此選取MWCNTs和PSA作為凈化吸附劑材料。

本實驗室前期研究結果表明，采用100 mg MWCNTs和100 mg PSA的復合填料制備的m-PFC凈化柱對茶葉提取液具有很好的凈化效果[19]，因此直接選取該2種凈化填料按照質量比1∶1充分混合后，稱取200 mg填裝至空m-PFC柱管中，通過上下篩板將填料固定制備成m-PFC凈化柱，將質量濃度為0.200 μg/mL的6種化合物的溶劑標準溶液直接過柱，流出液用等體積水稀釋后上機，考察其對特丁硫磷及5種代謝產物的吸附情況。由圖4可知，特丁硫磷及其代謝產物的回收率均在95%～103%之間，滿足方法學要求，說明該復合填料對目標待測物幾乎無吸附，適合用于特丁硫磷及其代謝產物的凈化。

圖4 特丁硫磷及5種代謝產物直接凈化回收率Fig. 4 Recoveries of terbufos and its five metabolites directly purified on m-PFC column

2.4 脫水劑含量的確定

按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中 第四法——卡爾·費休法測定當乙腈與飽和氯化鈉溶液比例為7∶3時，富乙腈相中的含水量為7.06%。1 mL待凈化乙腈提取液中約含水分0.07 g，為保障提取液中的水分充分被吸附，加入過量的無水硫酸鎂（100 mg）作為脫水劑。乙腈提取液中水分以及m-PFC柱中無水硫酸鎂的絕對量很少，不會因無水硫酸鎂吸水釋放大量的熱量而影響農藥的回收率。

綜上，選取100 mg MWCNTs和100 mg PSA作為吸附劑，100 mg無水硫酸鎂作為脫水劑復合后制備成m-PFC凈化柱進行后續實驗。

2.5 基質效應、線性關系、檢出限及定量限

2.5.1 基質效應

在液相色譜-質譜聯用法進行農藥檢測的過程中，基質效應普遍存在。基質效應的存在會抑制或加強目標化合物的電離，從而影響其定性和定量分析[36-37]。當基質效應在0.9～1.1范圍內時，則表明基質效應可忽略；當基質效應＜0.9時，具有基質抑制效應；當基質效應＞1.1時，具有基質增強效應[38]。分別制備綠茶、普洱茶和紅茶的空白基質標準，考察不同類型茶葉的基質效應。結果表明不同種類茶葉的基質效應差別較小，除特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON外，其他4種農藥的基質效應均在0.9～1.1范圍內。特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON的基質效應均在0.9以下，具有較強的基質減弱效應。為確保定量檢測結果的準確性，采取基質標準曲線定量。

2.5.2 線性關系、檢出限及定量限

選取不含特丁硫磷及其5種代謝產物的茶葉作為空白基質，準確配制質量濃度為1、5、10、50、100、200、500 μg/L的系列基質標準工作液上機分析。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果表明，6種化合物在1～500 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數（r2）均大于0.999。通過逐級稀釋基質標準溶液的方式，以信噪比3、10分別作為本方法的檢出限（limits of detection，LOD）、定量限（limits of quantification，LOQ），結果見表3。

表3 綠茶、普洱茶及紅茶中特丁硫磷及其代謝產物的基質效應、 線性相關系數、LOD及LOQTable 3 Matrix effect, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of terbufos and its metabolites in green tea, Pu-erh tea and black tea

2.6 回收率及精密度結果

選取空白綠茶、普洱茶、紅茶樣品，分別添加0.01、0.50、2.00 mg/kg的6種化合物，按照前述操作進行回收率實驗，每個添加量重復6 次，計算各農藥的回收率及精密度。結果表明，綠茶、普洱茶、紅茶中添加6種化合物的平均回收率為81.5%～103.9%，相對標準偏差為0.9%～10.1%（表4），結果符合農藥殘留檢測要求[39]。

表4 特丁硫磷及其代謝產物在綠茶、普洱茶和紅茶中的添加 回收率及精密度（n= 6）Table 4 Recoveries and RSDs of terbufos and its metabolites spiked in green tea, Pu-erh tea and black tea (n = 6)

2.7 茶葉基質樣品中特丁硫磷代謝模擬實驗

稱取1 g空白綠茶樣品，分別加入100 μg/mL的特丁硫磷標準溶液10.0 μL，同時加入100 μL 30% H2O2溶液，補水至2.0 mL，于室溫及自然光下分別放置24 h和72 h，然后按照1.3節方法進行提取、凈化及檢測分析，同時進行不加H2O2的對照實驗，模擬考察1.00 mg/kg添加量時，特丁硫磷在茶葉中的代謝情況，見表5。

表5 特丁硫磷代謝模擬實驗Table 5 Simulated degradation of terbufos in tea

根據實驗結果可知，特丁硫磷易氧化，在室溫下放置24 h后主要生成特丁硫磷亞砜和特丁硫磷砜，繼續放置至72 h，特丁硫磷亞砜的含量減少，進一步被氧化為特丁硫磷砜、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。在H2O2環境條件下的加速代謝模擬實驗中，特丁硫磷氧化更迅速，放置24 h后便完全消失（＜0.01 mg/kg），相較于對照組氧化生成了更多的特丁硫磷亞砜，且更早地檢測到了特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。本實驗表明，特丁硫磷的代謝產物并非只有GB 2763—2021列出的特丁硫磷亞砜和特丁硫磷砜，還至少會存在特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。無論在對照組還是H2O2組均未檢測到特丁硫磷-OXON，這可能是因為特丁硫磷-OXON是一種中間代謝產物，本身不穩定易于直接被氧化為特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。

2.8 實際樣品檢測

隨機選取40個茶葉樣品進行農藥的檢測分析，均未檢出特丁硫磷及其5種代謝產物。

3 結 論

本實驗將快速濾過型凈化手段與液相色譜-質譜技術相結合，建立茶葉中特丁硫磷及其5種代謝產物的檢測方法。相較于傳統的固相萃取法，本方法提取、凈化方法簡單快速，不必旋蒸、濃縮，大大提高了批量檢測的工作效率，方法的線性、回收率、精密度等均符合農藥殘留檢測要求。本研究建立特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON的檢測方法，為茶葉中特丁硫磷及其多種代謝產物殘留量的準確定量提供 技術手段。