響應面法優化閃式提取姜黃素工藝

董慶飛，蘇航，肖志勇，何洪，安鳳平，宋洪波*

1. 福建農林大學食品科學學院（福州 350002）；2. 福建農林大學金山學院（福州 350002）；3. 福建拓天生物科技有限公司（福州 350002）

姜黃（Curcuma longa）是我國大力推廣種植及對外出口的一種藥食兩用的多年生草本植物[1]。姜黃素作為傳統中藥，是干燥姜黃根莖中的主要成分之一。由于其抗氧化、抗炎、護肝、抗病毒、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抑制衰老等生物活性，常用于功能性食品方面研究[2-3]，所以提取姜黃素及其性質研究成為一大熱點。姜黃素的制備方法主要有酶法[4]、微波法[5]、超臨界CO2萃取法[6]、酸堿法[7]、超聲提取法[8]等。其中，提取效率最高的是酶法，但對酶的活性要求苛刻，對設備的要求高[4]。微波提取法的提取時間短、選擇性高，但泄漏的微波輻射會對人造成慢性損傷[5]。超臨界CO2萃取能維持生物活性，但不易大規模投入生產[9]。酸堿提取法提取成本低、工藝簡單，但提取過程中易使姜黃分解，并且對環境污染嚴重[7]。超聲提取法的提取率高、溫度低，但投資大、規模小，限制其發展[8]。提取姜黃素的傳統方法都有其局限性，考慮采用新的技術工藝提取姜黃素就顯得尤為重要。采用閃式提取法提取姜黃中姜黃素的研究較為罕見。閃式提取法具備耗時短、提取效率高、綠色環保、操作簡單等優勢，且可在室溫條件下進行操作[10]，能在保證安全的情況下最大限度地保留姜黃的有效成分。這一項技術的特點比傳統方法更快速地從植物中提取目標物質。

試驗采用閃式提取法從姜黃中制備姜黃素，通過單因素試驗研究不同工藝因素對姜黃素得率的影響，在此基礎上采用響應面法優化試驗得到最優提取工藝，以期為姜黃的開發提供可行途徑與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃（購于當地藥店）；姜黃素標準品（HPLC≥ 98%，成都艾科達化學試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

JHBE-50T閃式提取器（河南智晶生物科技股份有限公司）；UV-1780紫外分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）；TGL-16醫用冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；BSA2202S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；150B搖擺式高速中藥粉碎機（浙江溫州瑞安市永歷制藥機械有限公司）；EYEL4型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

參考王斌等[11]的方法測定，略有修改。準確稱取姜黃素標準品，配制標準品的梯度溶液，用80%乙醇溶液定容，用80%乙醇溶液作為空白對照。在430 nm處測定吸光度，記錄數據建立坐標系，橫坐標代表姜黃素質量濃度（mg/mL），縱坐標代表吸光度（AU），并計算出線性回歸方程：y=114.94x+0.131 1（R2= 0.991 1）。

1.3.2 姜黃素的提取

參考孫鵬堯等[12]的方法提取，略有修改。準確稱量10 g粉碎過篩的姜黃粉末置于燒杯，按照一定的料液比和乙醇體積分數添加至燒杯中，放置于閃式提取器下以一定轉速進行一定提取時間的制備。待提取結束后，在5 000 r/min、25 ℃條件下離心5 min，除去濾渣，取上清液，經旋轉蒸發后得到濃縮液。準確移取1 mL濃縮樣液，用80%乙醇固定體積至10 mL，參照

1.3.1 的方法測定吸光度。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 乙醇體積分數對姜黃素得率的影響

在料液比1∶30 g/mL、轉速5 000 r/min、提取時間60 s條件下，探究不同乙醇體積分數（50%，60%，70%，80%和90%）對姜黃素得率的影響。

1.3.3.2 料液比對姜黃素得率的影響

在乙醇體積分數70%、轉速5 000 r/min、提取時間60 s條件下，考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對姜黃素得率的影響。

1.3.3.3 提取時間對姜黃素得率的影響

在乙醇體積分數70%、料液比1∶30 g/mL、轉速5 000 r/min條件下，考察不同提取時間（40，50，60，70和80 s）對姜黃素得率的影響。

1.3.3.4 轉速對姜黃素得率的影響

在乙醇體積分數70%、料液比1∶30 g/mL、提取時間60 s條件下，考察不同轉速（2 000，3 500，5 000，6 500和8 000 r/min）對姜黃素得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

經顯著性分析后，結果發現料液比1∶30～1∶50 g/mL對姜黃素得率的影響較其他因素更低，所以選擇轉速、提取時間、乙醇體積分數顯著影響姜黃素得率的3個因素作為考察變量，以姜黃素得率作為響應值，采用Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken程序進行設計[13]，試驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平

1.3.5 得率的計算

姜黃素得率按式（1）計算。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次，結果用“平均值±標準差”的形式表示。使用Origin 8.0軟件繪圖，采用Excel 2016軟件、Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗結果得出的數據進行統計分析，采用SPSS 24.0軟件對試驗結果數據進行顯著性差異分析（p＜0.05具有統計學意義）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對姜黃素得率的影響

圖1顯示，隨著乙醇體積分數逐漸提高，姜黃素得率呈現先增加后降低趨勢。乙醇體積分數從50%增加到70%時，姜黃素得率呈現迅速升高趨勢，姜黃素得率在乙醇體積分數70%時達到最高值。造成這種現象的原因可能是70%乙醇的介電常數更高，更有利于溶劑的滲透[14]。乙醇體積分數高出70%，隨著乙醇體積分數繼續增大，姜黃素得率卻出現明顯降低趨勢。這是因為乙醇體積分數超過70%，由于高體積分數乙醇的介電常數會下降，從而阻止姜黃素的滲出，因此姜黃素得率急劇下降[14]。這與吳妙鴻等[15]用超聲波輔助醇提取法從姜黃中提取姜黃素的研究結果基本一致。

圖1 乙醇體積分數對姜黃素得率的影響

2.1.2 料液比對姜黃素得率的影響

圖2顯示，隨著料液比不斷減小，姜黃素得率呈現先增加后降低趨勢。料液比從1∶10 g/mL減小到1∶30 g/mL時，姜黃素得率隨料液比減小而迅速升高，料液比1∶30 g/mL時達到最高，造成這種現象的原因可能是隨著溶劑增加，料液的濃度差也在增加，這有利于溶質的擴散[16]。繼續減小料液比到1∶40 g/mL，得率并沒有顯著變化，可能是由于樣品已基本完成固液的轉移，對得率未造成明顯影響[17]。但繼續增加溶劑使料液比達到1∶50 g/mL，姜黃素的得率卻呈現出迅速下降趨勢，可能是由于溶劑比例增大使得閃式提取器的刀頭無法與樣品充分接觸，使樣品中溶質難以溶出[18]。這與羊青等[19]用乙醇回流法從姜黃根莖中提取姜黃素的試驗結果類似，但可能是樣品差異等原因使得料液比1∶30～1∶40 g/mL范圍內對姜黃素得率的影響不顯著。

圖2 料液比對姜黃素得率的影響

2.1.3 提取時間對姜黃素得率的影響

圖3顯示，總體上姜黃素得率隨著提取時間增加而呈現先增加后降低趨勢。提取時間從40 s增加到60 s時，姜黃素的得率隨提取時間逐漸延長而呈現明顯升高趨勢，得率達到最高點時的提取時間為60 s，可能是因為提取時間增加，充分的剪切使細胞膜破碎程度加大，增加姜黃素類化合物的溶出，得率增加[20]。提取時間延長到60 s以上，姜黃素得率呈現急劇降低趨勢，可能提取時間過久導致閃式提取器刀頭高速剪切作用使部分機械能轉化為熱能，引起液體溫度升高，高溫導致姜黃素類化合物分解[21]。該結果與張雄等[20]采用閃式提取法從猴頭菇中同步提取多糖和蛋白質的研究結果大體一致。

圖3 提取時間對姜黃素得率的影響

2.1.4 轉速對姜黃素得率的影響

圖4顯示，姜黃素得率隨著轉速逐漸升高而呈現先升高后降低趨勢。轉速處于2 000～5 000 r/min范圍內，姜黃素得率隨著轉速增大而明顯增大，轉速5 000 r/min時得率到達最高，可能是因為隨著轉速在原料顆粒表面產生較強的剪切及湍流、較高的負壓，從而促進姜黃素從細胞中釋放[22]。轉速從5 000 r/min逐漸升高到8 000 r/min，姜黃素得率急劇下降，可能是過高轉速的強剪切可一定程度破壞分子結構[23]，因此使姜黃素得率下降。這與Cheng等[22]采用粉碎組織提取技術（STE）從五味子中提取木質素的研究結果類似。

圖4 轉速對姜黃素得率的影響

2.2 響應面試驗分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

根據單因素試驗結果，將料液比固定為1∶30 g/mL，以轉速、提取時間、乙醇體積分數為試驗因素，以姜黃素得率為響應值，利用Box-Behnken試驗設計對閃式提取姜黃素的工藝條件進行二次多項回歸方程的擬合及優化。試驗結果見表2。

表2 姜黃素得率的響應面試驗設計和結果

根據表2的試驗結果，用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗數據進行多項式擬合分析處理，通過計算得出姜黃素得率（Y）與轉速（X1）、提取時間（X2）和乙醇體積分數（X3）之間的二次多項回歸方程：Y=62.55+ 0.24X1+1.9X2+1.3X3-1.18X1X2-1.52X1X3+2.32X2X3-2.27X12-4.31X22-2.27X32。

為進一步分析獲得的回歸方程的擬合度，根據表2的試驗數據對模型進行ANOVA方差分析。如表3所示：擬合方程的p值小于0.000 1，說明試驗建立的模型極顯著；失擬項的p值為0.204 6，大于0.05，表明失擬項沒有顯著差異。回歸方程的確定系數為R2=0.991 2，表明建立的模型能解釋99.12%響應值的變化[24]。該模型的擬合程度較好，能反映響應面值的變化，誤差范圍小，可用該回歸方程預測和分析姜黃素得率的最優條件。通過表3利用F檢驗可以觀察確定這三個因素對姜黃素得率的影響大小：提取時間＞乙醇體積分數＞轉速；從表3可以看出一次項提取時間（X2）、乙醇體積分數（X3），交互項X1與X2、X1與X3、X2與X3，以及二次項X12、X22、X32對姜黃素得率的影響均達到極顯著水平。

表3 回歸系數和方差分析

2.2.2 響應面交互分析

根據擬合的回歸方程，每2個因素之間對姜黃素得率作響應面3D和二維等高線圖（見圖5）。響應面的變化情況和等高線圖的疏密情況能夠直觀地反映因素之間的交互作用對姜黃素得率的影響，二維等高線圖表現為橢圓形或者響應面3D圖表現為馬鞍形的時候，即為2個因素之間的交互作用顯著[26]。二維等高線圖的形狀愈接近橢圓形，說明其自變量之間的交互作用對因變量的影響愈大[27]。

兩因素之間的交互作用對姜黃素得率的影響見圖5。當轉速、提取時間與乙醇體積分數三者中任意一個因素是零水平時，其余2個因素之間的交互作用對姜黃素的得率的影響均是隨著2個因素的升高而呈現出先升高后下降的趨勢。圖5（a）與圖5（b）等高線圖顯示的橢圓形大小基本一致，說明轉速與提取時間的交互作用和轉速與乙醇體積分數的交互作用對姜黃素得率影響的顯著性大小基本一致。圖5（c）等高線顯示的橢圓形表現得最大，曲率半徑較圖5（a）與圖5（b）更大[28]，說明提取時間與乙醇體積分數的交互作用對姜黃素得率的影響極顯著。這一結果印證表3中回歸系數和方差分析的結果。3組響應面3D圖均是平滑曲面，并且開口朝下，因此表明姜黃素得率的最大值在該測量范圍之內。

圖5 各因素間的交互作用對姜黃素得率的影響

2.2.3 最佳條件預測與驗證

通過建立的模型預測，得到閃式提取姜黃素的最佳工藝條件：乙醇體積分數74.507%、料液比1∶30 g/mL、時間63.682 s、轉速4 707.271 r/min，在該工藝條件下姜黃素的得率為63.17 mg/g。為方便實際操作，將試驗條件調整為乙醇體積分數74%、料液比1∶30 g/mL、時間64 s、轉速5 000 r/min。為驗證模型的有效性，在調整后的提取工藝條件的參數下進行3次平行提取試驗驗證，結果發現姜黃素得率為62.79±0.14 mg/g，與預測值（63.06 mg/g）相近并無顯著差異。該結果證實模型的可預測性，說明經過響應面優化的提取條件重復性好，結果可靠。

3 結論

以姜黃為原料，采用閃式提取法提取姜黃素。通過單因素分析，發現料液比對姜黃素得率整體上影響顯著，但在1∶30～1∶40 g/mL范圍內對姜黃素得率的影響不顯著。通過響應面分析，結果發現乙醇體積分數與提取時間對姜黃素得率有顯著影響。提取姜黃素的最優工藝條件為乙醇體積分數74%、料液比1∶30 g/mL、提取時間64 s、轉速5 000 r/min，在此條件下姜黃素得率可達62.79±0.14 mg/g。該方法提取的姜黃素得率高于微波輔助酶解法（21.96 mg/g）[4]和超聲提取方法（9.618 mg/g）[8]。由此看出，閃式提取法在姜黃素提取中具有潛在應用價值。