銀杏葉多糖對發酵乳品質及抗氧化活性的影響

賀瑩，王連

呂梁學院生命科學系（呂梁 033000）

銀杏是一種水生裸子葉植物。銀杏全株都是寶，根、皮、葉、果具有很高的醫用藥物和可食用觀賞價值[1]。銀杏葉的營養成分主要為VC、VE、胡蘿卜素及鈣、磷、硼、硒等礦物元素含量也十分豐富，超過一般水果蔬菜及可食植物原料[2]。有研究表明銀杏葉多糖具有增強抗腫瘤和抗炎抑菌的醫療功效，同時它還具有自由基抵抗病毒清除作用、延緩衰老、擴張局部腦血管血液循環、促進腦部血液循環、抗氧化[3]等醫療作用。銀杏葉多糖可以抑制老年人急性早幼粒白血病的異常細胞分化增殖，同時可以抑制惡性癌細胞的分化增殖[4]。試驗以銀杏葉多糖為主要研究對象，分析不同銀杏葉多糖添加量對發酵乳的酸度、乳酸菌活菌數、持水力度、抗氧化活性等的影響，以期開發出銀杏葉多糖的功能性食品，為銀杏葉多糖發酵乳研發提供理論基礎[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

銀杏葉多糖（從購于安徽合肥市的銀杏葉中提取）；伊利學生營養奶粉；白砂糖（食品級，磁縣田好食品有限公司）；酸奶發酵劑（北京川秀國際貿易有限公司）；正丁醇、乙醇、雙氧水、硫酸亞鐵（分析純，天津市大茂化學試劑廠）。

SC-04型離心機（鹽城市凱特實驗用儀器廠）；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋、DF-101S電熱恒溫培養箱、電熱鼓風干燥箱（101-2A）（均為上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；HC60001電子天平（無錫瑪瑞特科技實業有限公司）；PHS-3E pH計（上海精密化學儀器有限公司）；UV-3100PC紫外分光光度計（上海美普達有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀杏葉多糖的制備

1.2.1.1 工藝銀杏葉多糖的提取流程

原料采摘清洗→干燥→粉碎→過稱，加水→恒溫浸提→（隔夜后）過濾→離心→恒溫水浴濃縮→ Sevage法除去蛋白→離心→95%乙醇沉淀→（隔夜）離心→干燥（60 ℃烘干）

1.2.1.2 操作要點

將清洗過的新鮮銀杏葉風干、粉碎，用電子天平稱取150 g銀杏葉粉，按照料液比1∶10（g/mL）加水，樣品溶液置于85 ℃恒溫水浴鍋中進行提取，隔夜后用8層紗布對樣品進行過濾，提取后將濾液在4 000 r/min下離心20 min，重復操作2次，獲取樣品上清液。在80 ℃的恒溫水浴鍋對離心液進行濃縮。用Sevage法除去樣品中的沉淀物蛋白質，離心2次；在快速獲得上清液加入3倍體積的95%乙醇，隔夜在低溫冷藏（4 ℃）條件下繼續保存；對樣品沉淀后的上清液和白色絮狀多糖進行離心，進行高溫水浴蒸干后，放入55 ℃干燥箱中烘干，即可快速獲得白色銀杏葉絮狀多糖[5]。

1.2.2 銀杏葉多糖發酵酸乳的制備

配制100 mL的新鮮純牛奶，在60 ℃恒溫條件下加入5 g的蔗糖攪拌溶解后，分別在牛奶中加入0，0.05%，0.10%，0.15%，0.20%和0.25%的銀杏葉多糖，在100 ℃左右的條件下進行巴氏殺菌8 min左右，放置在室溫的條件下進行冷卻，將樣品分別接種1.0%保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌復合粉。恒溫培養箱設置45 ℃，樣品進行低溫發酵6 h。經冷卻后放入冰箱的冷藏層，后熟24 h制得銀杏葉多糖益生菌發酵乳[6]，以添加銀杏葉多糖比例0的樣品為試驗對照組。

1.2.3 乳酸菌活菌數的測定

加入不同濃度的銀杏葉多糖的發酵乳，進行乳酸發酵，24 h后采用平板計數法[7]測定乳酸菌的數量和菌落。

1.2.4 酸度的測定

pH測定采用精密pH計測定（pH計使用前務必進行校準，否則會影響試驗的準確度）。

1.2.5 持水力的測定

稱定15 mL離心管質量，記為W0；加入10 mL銀杏葉多糖發酵乳，離心，此時離心管質量記為W1；經離心的樣品靜置10 min后棄去上清液，稱其質量，記為W2。重復測定3次，最終取平均值。持水力（W）按式（1）計算。

1.2.6 羥基自由基清除率的測定

樣品用95%乙醇配制成0.10 g/mL質量濃度的樣品溶液，向樣品中依次加入H2O2、硫酸亞鐵和水楊酸，混合均勻后，在35 ℃水浴中繼續加熱30 min，設置在510 nm處測定樣品的吸光度Ai，用蒸餾水將樣品溶液清除作為空白對照，其樣品所測得吸光度A0，加入H2O2代替為蒸餾水時，測得樣品的吸光度Aj，分別平行操作3次[8]。羥基自由基清除率（A）按式（2）計算。

1.2.7 DPPH自由基清除率的測定

溶液中加入3 mL的DPPH-乙醇混合溶液配制質量濃度為0.1 g/mL的溶液，在30 ℃水浴加熱0.5 h后，在510 nm波長測得DPPH-乙醇溶液試樣吸光度（Ai），以3 mL蒸餾水代樣品溶液測得空白吸光度（A0），以3 mL的95%乙醇溶液平行代替3 mL的DPPH-乙醇溶液，測得樣品吸光度（Aj），每個樣品平行測定3次，取其吸光度的平均值[9]。DPPH自由基清除率（A）按照式（3）計算。

1.2.8 Fe3+還原能力

樣品均用95%鹽酸乙醇溶液配制合成質量濃度0.10 g/mL溶液，在3 mL樣品中溶液中依次加入鐵氰化鉀溶液（0.8 mol/L）和2倍體積的磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L）各3 mL，在50 ℃條件下保溫30 min后，取其混合，分別加入10%三氯乙酸溶液3 mL，以4 000 r/min混合離心15 min后取其上清液3 mL，加入3 mL蒸餾水和0.2 mL的0.1%三氯化鐵溶液，常溫的工作條件下反應15 min后，最終在680 nm波長的條件下測定吸光度[10-11]，重復進行測定3次。

1.3 數據處理

采用Origin繪圖軟件繪制銀杏葉多糖對酸乳影響趨勢圖，采用SPSS 25.0軟件進行顯著性分析抗氧化活性[12]。

2 結果與分析

2.1 銀杏葉多糖對發酵乳乳酸菌菌落的影響

由表1可知：隨著銀杏葉多糖含量增加，發酵酸乳的活菌數目呈遞增的變化趨勢，從1.36×108CFU/mL增加到（2.26±0.35）×108CFU/mL，說明銀杏葉多糖添加量0.15%時，其益生菌乳酸菌菌落數明顯高于對照組（p＜0.05），說明銀杏葉多糖可以有效促進植物乳酸菌和其他代菌落的代謝和增殖。

表1 銀杏葉多糖添加量對發酵乳乳酸菌菌落的影響

2.2 銀杏葉多糖對發酵乳酸度的影響

由圖1可知：銀杏葉多糖添加量逐漸遞增，發酵酸乳的酸度pH呈現下降趨勢，而且不同的銀杏葉多糖添加量發酵酸乳的pH都顯著性低于對照組（p＜ 0.05），這與pH試紙測定的結果相對一致。發酵乳pH的降低主要因素是乳酸菌的生長，多糖類的物質在發酵過程中產生的有機酸。pH與發酵乳酸乳的風味相關，且會影響食品安全。降低發酵酸乳pH，不僅可以改善發酵酸乳的風味和組織形態，同時還可以抑制有害微生物的生長，延長酸乳的儲存期。

圖1 銀杏葉對發酵乳酸度的影響

2.3 銀杏葉多糖對發酵乳持水力的影響

由圖2可知，當銀杏葉多糖添加量逐漸遞增，發酵酸乳的持水力呈先上升后下降的變化，不同銀杏葉多糖添加量對發酵乳的持水力都有明顯增強的效果，且銀杏多糖添加量0.15%時，發酵乳的持水力達到最高值。發酵酸乳中有大量的酪蛋白成分，蛋白質中氨基酸分子之間可以形成致密的網狀膠體結構，該結構可以容納水及其他多種物質，因此可以提高持水性能。銀杏葉多糖添加量高于0.20%后，由于過量的糖被破壞蛋白質的凝聚作用，導致乳清析出過多，引起持水力下降。

圖2 銀杏葉多糖對發酵乳持水力的影響

2.4 銀杏葉多糖對發酵乳羥基自由基清除率的影響

由圖3可知：與對照組發酵乳的羥基自由基清除率相比，隨著銀杏葉多糖含量增加，發酵酸乳清除羥基自由基清除率呈現逐漸升高趨勢，清除率到峰值，各處理組和空白對照組之間的羥基自由基清除率具有顯著性差異（p＜0.05）。說明添加一定量的銀杏葉多糖可以有效提高發酵酸乳的羥基自由基清除能力。銀杏葉多糖可能是一種良好的電子供體，供給羥基自由基后將其還原為OH-，從而導致羥基自由基清除。

圖3 銀杏葉多糖對發酵乳羥基自由基清除率的影響

2.5 銀杏葉多糖對發酵乳DPPH自由基清除率的影響

由圖4可得：隨著銀杏葉多糖添加量的增加，與對照組發酵乳的DPPH自由基清除率相比，發酵乳的DPPH自由基清除出現逐漸遞增趨勢，清除率最高的對照組可達75%，并且各組的清除處理明顯高于其他對照組（p＜0.05）。結果表明，添加適量銀杏葉多糖可有效提高發酵乳的DPPH自由基清除力。銀杏葉多糖在生化反應中作為一種供氫自由基物質，與自由基離子發生反應生成穩定的自由基物質，抑制其與DPPH自由基陽離子所發生的反應。

圖4 銀杏葉多糖對發酵乳DPPH自由基清除率的影響

2.6 銀杏葉多糖對發酵乳Fe3+還原力的影響

由圖5可知：隨著銀杏葉多糖添加量增加，發酵乳的Fe3+的化學還原和抗氧化能力均有很大提高，而且不同銀杏葉多糖添加量對發酵乳的Fe3+還原和抗氧化能力均高于空白對照組（p＜0.05）。結果表明，大部分中發酵乳的Fe3+轉化為Fe2+。銀杏葉多糖可使其發酵乳很好地成為一種良好的活性電子物質供體，具有很好的化學還原和抗氧化性能，除了可將樣品中的大部分Fe3+轉化為Fe2+，還可與自由基化學等物質直接發生抗氧化反應，從而形成穩定的物質。因此，銀杏葉多糖可以大幅提高發酵乳的還原和抗氧化能力。

圖5 銀杏葉多糖對發酵乳Fe3+還原力的影響

2.7 最佳銀杏葉多糖對酸乳抗氧化活性的影響

由SPSS 25.0軟件、Origin-2019軟件分析銀杏葉多糖對酸乳的乳酸菌落總數、酸度、持水力度、抗氧化活性的顯著性分析，可得出銀杏葉多糖含量對酸乳的最佳益生效果。銀杏葉多糖添加量0.15%時，其持水力和抗氧化活性達到最優。添加銀杏葉多糖可以有效改善發酵酸乳的組織狀態和風味，抑制有害微生物的增殖，延長發酵乳的最佳品嘗期。

3 結論

以銀杏葉為原料，采用銀杏葉水提醇沉法、Sevage法除蛋白等方法進行提取銀杏葉多糖，將銀杏葉多糖添加到純奶中進行發酵，通過顯著性分析數據，得到銀杏葉多糖對酸乳的影響趨勢圖，分析銀杏葉多糖對發酵乳的最佳影響發展趨勢及發酵最佳效果，從而得出銀杏葉發酵多糖添加量0.15%時，其持水力和抗氧化活性達到最優。適量添加銀杏葉多糖可以有效改善發酵酸乳的組織狀態和風味，可為生產和食品應用提供參考。