響應(yīng)面法優(yōu)化酶解提取綏江苦丁茶香料浸膏的工藝

包秀萍，李鋒，劉友杰，李寶志，付祺，樸永革*

1. 云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司（昆明 650106）；2. 吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司（長春 130000）

苦丁茶種類眾多，大致分為木樨科、冬青科、金絲桃科、紫草科、馬鞭草科。主要分布于西南地區(qū)和沿海多雨地區(qū)，沿海地區(qū)以冬青科苦丁茶最多，西南地區(qū)為木樨科的幾種女貞苦丁茶[1-6]。云南綏江苦丁茶屬于木樨科紫莖女貞，含有豐富的皂甙、萜類、黃酮類物質(zhì)[7-11]，是上等的綠色健康佳品，其嗅香為清雅茶韻，口感津甜回甘，湯色為明亮的黃綠色。

酶法提取在天然產(chǎn)物提取中應(yīng)用廣泛，在一定條件的水環(huán)境中充分破壞植物細(xì)胞壁，有效提升植物細(xì)胞中的有效組分的溶出，有關(guān)報(bào)道研究酶解提取冬青科苦丁茶中的熊果酸、酶法提取鐵觀音中的茶多酚、黃酮等物質(zhì)[12-24]。但是對(duì)綏江紫莖女貞苦丁茶香料浸膏的酶法提取未有報(bào)道，通過響應(yīng)面法優(yōu)化[25-27]綏江苦丁茶香料浸膏的酶解條件，萃取其萜類等香味成分，并用氣相色譜-質(zhì)譜法[28]對(duì)揮發(fā)性致香成分進(jìn)行分析和鑒定，與未經(jīng)酶解的綏江苦丁茶香料浸膏進(jìn)行對(duì)比分析，為綏江苦丁茶作為香料浸膏的廣泛應(yīng)用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器、試劑

綏江苦丁茶（云南省綏江縣）。

Agilent 6890N/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；BUCHIR-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；SHZ-D（Ⅲ）。蒸餾萃取裝置（自制）。

Viscoflow MG復(fù)合植物水解酶[活力80 U/g，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司]；乙醇[95%（V/V），食品級(jí)，云南汕滇藥業(yè)有限公司]；無水硫酸鈉（AR，廣東汕頭市西隴化工廠）；二氯甲烷（AR，天津市博迪化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

綏江苦丁茶為原料，酶解時(shí)以3倍水（原料質(zhì)量計(jì)）為溶劑，按設(shè)計(jì)條件進(jìn)行酶解，并加入10倍95%酒精進(jìn)行回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾回收溶劑，所得樣品為綏江苦丁茶香料浸膏。

1.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

因素水平提取工藝設(shè)計(jì)：根據(jù)有關(guān)資料和預(yù)備單因素試驗(yàn)，以酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解pH為主要影響因素，以測得綏江苦丁茶香料浸膏樣品得率為考察指標(biāo)，利用響應(yīng)面法的Box-Behnken Design設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以-1，0和+1編碼，以苦丁茶的萃取率為響應(yīng)值進(jìn)行萃取工藝因素水平設(shè)計(jì)（表1）。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼

萃取率按式（1）計(jì)算。

1.2.3 GC-MS分析條件

1.2.3.1 色譜條件

TR-5MS，60 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣，氦氣（99.999%）；進(jìn)樣量1 mL；分流比15∶1；柱流速，恒流0.8 mL/min。程序升溫：初始溫度80 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升至240 ℃，保持30 min。傳輸線溫度250 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

EI能量70 eV，溶劑延遲6 min，掃描離子范圍50～650 amu。定性分析采用NIST08質(zhì)譜譜庫檢索；定量分析采用歸一化法。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

按照響應(yīng)面法的Box-Behnken Design的試驗(yàn)方案進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

試驗(yàn)方案的15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中包括12個(gè)析因點(diǎn)（1～12）及3個(gè)中心點(diǎn)（13～15），以綏江苦丁茶香料浸膏的萃取率Y作為響應(yīng)面分析的響應(yīng)值。

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到綏江苦丁茶香料浸膏萃取率（Y）對(duì)酶解溫度（A）、酶解pH（B）和酶解時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程模型為：Y=-299.058 33+6.312 08A+54.120 83B+0.878 611C+ 0.255 000AB-0.003 083AC-0.005 833BC-0.068 333A2- 6.183 33B2-0.005 565C2。

該二次回歸方程方差分析結(jié)果和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。3因素交互作用對(duì)綏江苦丁茶香料浸膏萃取率的響應(yīng)面分析結(jié)果見圖1～圖6。

表3 回歸方程模型的方差分析結(jié)果

由表3數(shù)據(jù)和圖1～圖6可以看出，該模型統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上差異極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著，說明沒有未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾。模型的決定系數(shù)R2為0.990 7，修正決定系數(shù)R2為0.974 1，大于0.9，說明模型能解釋綏江苦丁茶香料浸膏萃取率響應(yīng)值的變化。該模型與實(shí)際情況擬合較好，可用于分析和預(yù)測酶解萃取綏江苦丁茶的實(shí)際情況。

圖1 酶解溫度-酶解pH對(duì)萃取率的等高線圖

圖6 酶解pH-酶解時(shí)間對(duì)萃取率的響應(yīng)面分析

圖2 酶解溫度-酶解pH對(duì)萃取率的響應(yīng)面分析

圖3 酶解溫度-酶解時(shí)間對(duì)萃取率的等高線圖

圖4 酶解溫度-酶解時(shí)間對(duì)萃取率的響應(yīng)面分析

圖5 酶解pH-酶解時(shí)間對(duì)萃取率的等高線圖

由表3可知，一次項(xiàng)A和B差異極顯著（p＜0.01），C差異不顯著（p＜0.01）。說明酶解溫度和pH對(duì)綏江苦丁茶香料浸膏萃取率有極顯著影響，而酶解時(shí)間影響不顯著。二次項(xiàng)A2、B2和C2均極顯著水平（p＜ 0.01）。A和B交互項(xiàng)差異也是極顯著（p＜0.01），說明這2個(gè)因素交互作用對(duì)綏江苦丁茶香料浸膏萃取率有極顯著影響。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型與測定的可靠性，對(duì)方程最優(yōu)條件（酶解溫度53.57 ℃、酶解pH 5.32和酶解時(shí)間61.33 min）進(jìn)行3次試驗(yàn)（為方便操作，實(shí)際采用酶解溫度53 ℃、酶解pH 5.3和酶解時(shí)間60 min），綏江苦丁茶香料浸膏萃取率的平均值為40.45%，與通過Design Expert軟件優(yōu)化后的回歸方程求解得到的預(yù)測值40.94%接近，這說明該模型較可靠，響應(yīng)面法適用于對(duì)綏江苦丁茶香料浸膏的酶解萃取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.2 綏江苦丁茶香料浸膏樣品的揮發(fā)性成分分析

通過酶解提取苦丁茶香料浸膏，能夠有效提高苦丁茶浸膏萃取率，與未酶解的苦丁茶香料浸膏對(duì)比，主要有效成分含量顯著提升，其揮發(fā)性成分總離子流圖見圖7。

圖7 綏江苦丁茶香料浸膏揮發(fā)性成分的總離子流圖

據(jù)表4可知，經(jīng)酶解提取的綏江苦丁茶香料浸膏的揮發(fā)性成分共鑒定出化合物51種，與未經(jīng)酶解提取的綏江苦丁茶香料浸膏（32種化合物）對(duì)比，多了19種成分，且苦丁茶中的主要化合物芳樟醇、α-松油醇、香葉醇、橙花醇、脂肪酸酯類等含量明顯高于未經(jīng)酶解的苦丁茶香料浸膏，說明酶解能夠充分破壞苦丁茶細(xì)胞壁，利于苦丁茶細(xì)胞組織中的成分高效溶出，提高苦丁茶浸膏的萃取率，且提升苦丁茶中的主要揮發(fā)性化合物的含量。

表4 綏江苦丁茶香料浸膏揮發(fā)性化學(xué)成分 單位：μg/g

3 結(jié)論

綏江苦丁茶香料浸膏酶解提取工藝的最佳組合實(shí)際采用酶解溫度53 ℃、酶解pH 5.3和酶解時(shí)間60 min，進(jìn)行驗(yàn)證說明結(jié)果可靠。

揮發(fā)性成分分析結(jié)果表明：綏江苦丁茶香料浸膏中含有大量的致香成份，如芳樟醇、α-松油醇、香葉醇、橙花醇、脂肪酸酯類等物質(zhì)，與未酶解的綏江苦丁茶香料浸膏揮發(fā)性成分對(duì)比，經(jīng)過酶解提取工藝制備的綏江苦丁茶香料浸膏中的主要揮發(fā)性成分含量較未酶解的高2倍以上。除此之外，酶解提取還能夠充分溶出綏江苦丁茶中大量揮發(fā)性物質(zhì)，有效增加綏江苦丁茶香料浸膏揮發(fā)性物質(zhì)的豐富性，具有顯著的清雅茶香氣和香味，是一種高品質(zhì)的香料浸膏。為提升綏江苦丁茶原料和綏江苦丁茶香料浸膏的利用奠定基礎(chǔ)。