大目金槍魚魚皮酸溶性膠原蛋白的提取及其特性

周舒瑤，李桂芳，馮如意，張園蕾，趙碧瑩，唐云平

浙江海洋大學食品與藥學學院浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心（舟山 316022）

膠原蛋白幾乎存在于脊椎動物的所有器官中，是皮膚、骨骼、肌腱、軟骨、血管和牙齒的主要結構元素[1-2]。其中常見的膠原蛋白為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，而I型膠原蛋白在成年動物皮中占主要比例[2]。膠原蛋白由于其良好的生物相容性和可降解性、保水和吸水特性，且免疫原性低，因而在食品、化妝品、制藥以及醫用材料等領域具有廣泛的應用[3-5]。

膠原蛋白的傳統生產方法為從豬和牛的皮膚和骨骼中分離提取。然而，由于瘋牛病、禽流感等疾病的爆發，人們對陸生動物制備膠原蛋白的安全性產生了質疑[5-6]。因此，有必要尋找更加安全的膠原蛋白來源。相比于陸源性膠原蛋白，海洋膠原蛋白的來源更為豐富，大約70%的地球表面都被海洋所覆蓋，海洋孕育了品種繁多、數量龐大的生命體。大量的膠原蛋白已從無脊椎動物（墨魚、海膽、水母等）和脊椎動物（魚類等）中提取獲得。

金槍魚是世界上重要的經濟魚類。2018年全球金槍魚估計收獲量為750萬 t[7]。在中國，每年處理的金槍魚數量約為20萬 t。由于金槍魚僅將白肉用于制作生魚片或罐頭，金槍魚產業會產生大量副產品，包括魚頭、魚骨、魚皮和魚鱗等。如何利用這些加工廢棄物制備具有高附加值的生物制品是急需解決的問題。試驗以大目金槍魚皮為原料，利用酸法提取制備酸溶性膠原蛋白（ASC），隨后測定其分子量、氨基酸含量、紅外光譜和重金屬含量等相關參數，并利用MTT法和LDH法評價其對NIH-3T3成纖維細胞的細胞毒性和致敏性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大目金槍魚魚皮，由浙江大洋世家股份有限公司（中國舟山）提供。彩色預染中分子量蛋白質標準（10～180 kDa），購自上海碧云天生物技術有限公司。十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺（Acr）、二甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、溴酚藍、考馬斯亮藍R-250、過硫酸銨等，購自上海生工生物有限公司；其他均為國藥試劑分析純。

1.2 儀器與設備

SSW-420-2S恒溫水浴鍋（上海民儀電子有限公司）；PHS-250 pH計（上海理達儀器廠）；CF16RXП日立低溫離心機（日本日立公司）；ALPHA 1-4/LD plus冷凍干燥機（德國Christ ALPHA公司）；電泳儀（美國BIO-RAD公司）；L-8800氨基酸自動檢測儀（日本日立公司）；IB-3型離子涂布機（日本Eiko公司）；FI/IR-4100型傅立葉紅外光譜儀（日本JASCO公司）；ICP-MS（美國Agilent公司）；JSM-840型掃描顯微鏡（日本JEOL公司）等。

1.3 大目金槍魚魚皮的預處理

將大目金槍魚魚皮去除多余的魚肉和魚鱗，洗凈瀝干后剪成0.5 cm × 0.5 cm的小塊，按料液比為1∶10的比例用0.1 mol/L的NaOH溶液處理24 h用于脫除雜蛋白，每8 h更換一次NaOH溶液。隨后，將魚皮用冷蒸餾水洗滌至中性，并按料液比1∶20 g/mL用10%（V/V）正丁醇脫脂24 h，每8 h更換一次正丁醇溶液。隨后，用蒸餾水洗去正丁醇，瀝干獲得脫脂脫雜蛋白的魚皮。

1.4 酸法酸溶性膠原蛋白（ASC）的提取

取預處理的魚皮3 g，按料液比1∶20 g/mL加入0.5 mol/L的醋酸溶液，置于低溫搖床上進行酸解24 h。將酸解后的溶液在12 000 r/min，4 ℃下離心10 min，收集上清液。將上清液用蒸餾水進行透析至中性，將透析后的溶液進行冷凍干燥后即獲得ASC。

1.5 SDS-PAGE凝膠電泳

SDS-PAGE電泳步驟根據Tang等[8]的方法。將ASC樣品溶解在0.1 mol/L乙酸中，溶解的ASC樣品與蛋白樣品緩沖液混合，在沸水浴中加熱5 min，取ASC（30 μg）樣品使用8%分離膠進行電泳。采用彩色預染中分子量蛋白質標準用于估計ASC的分子量，用小鼠Ⅰ型膠原蛋白作為對照。

1.6 氨基酸含量測定

取0.02 g ASC，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液并進行氮封，于110 ℃水解24 h。待水解液冷卻至室溫，用旋轉蒸發儀50 ℃脫酸處理，將殘留物定容至50 mL，再向其中加入5 mL 0.02 mol/L HCl溶液復溶，振蕩混勻，用0.20 μm的濾膜過濾，用氨基酸自動檢測儀進行氨基酸含量的測定。羥脯氨酸采用氯胺T法進行測定。

1.7 紅外光譜的測定

采用FTIR對ASC二級結構的組成進行分析，將冷凍干燥的產物以1∶5的質量比與溴化鉀（KBr）混合并壓制成顆粒，以空氣為背景，使用布魯克Tensor 27型傅立葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1之間的范圍內進行測定。

1.8 重金屬含量的測定

將ASC（0.5 mg/mL）溶解在去離子水中（35 ℃），然后在環境溫度下冷卻至室溫，使用電感耦合等離子體-質譜法（ICP-MS）分析ASC產品中重金屬Pb、Hg和As的含量。

1.9 掃描電鏡

將ASC樣品固定于載物片上，將ASC進行撕裂呈現小斷面后進行真空噴金處理，然后采用超高分辨率場發射掃描電子顯微鏡JSM-7800進行觀察拍照，放大倍數為100，500和2 000倍。

1.10 細胞毒性試驗分析

將小鼠成纖維細胞NIH-3T3接種于96孔板（1× 105個細胞/孔），置溫度37 ℃、含5% CO2的無菌培養箱中培養24 h。設置對照組和試驗組，試驗組分別加入含不同質量濃度ASC（6.25，12.5，25，50和100 μg/mL，pH 7.0）的培養液，對照組加入同等體積不含ASC的培養液，每組設6個復孔。隨后放入培養箱中繼續培養24 h。取出96孔板，加入200 μL用PBS以1∶9稀釋的MTT溶液，繼續培養4 h。用排槍將MTT廢液吸出，加入150 μL二甲亞砜（DMSO）并放置于振蕩器上振蕩反應10 min。反應結束后，在490 nm下測定各孔的吸光度。細胞活性按式（1）計算。

1.11 細胞致敏性分析

將小鼠成纖維細胞NIH-3T3接種于96孔板（1× 105個細胞/孔），置溫度37 ℃、含5% CO2的無菌培養箱中培養24 h。設置對照組和試驗組，試驗組分別加入含不同質量濃度ASC（6.25，12.5，25，50和100 μg/mL，pH 7.0）的培養液，對照組加入同等體積不含ASC的培養液，每組設6個復孔。隨后放入培養箱中繼續培養24 h。培養結束后按乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒進行操作，測定LDH的相對釋放率。LDH相對釋放率按式（2）計算。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳

利用酸法從大目金槍魚魚皮中獲得ASC，采用SDS- PAGE電泳評價其純度和分子量。如圖1所示，電泳圖條帶清晰且無雜帶，表明提取得到的ASC純度較高。通過SDS-PAGE電泳可見ASC由兩個α1和一個α2鏈組成，在圖中亦可見β鏈（二聚體）和少量的γ鏈（三聚體）。結果表明I型膠原蛋白是大目金槍魚魚皮中的主要膠原蛋白。該結果與Lin等[9]利用等電法提取的大目金槍魚魚皮酶溶膠原蛋白（PSC）的結果一致。

圖1 大目金槍魚魚皮ASC的SDS-PAGE圖

2.2 氨基酸組成分析

ASC的氨基酸組成如圖2所示。ASC富含甘氨酸（19.73%）、谷氨酸（9.37%）、丙氨酸（8.87%）、精氨酸（7.40%）、脯氨酸（10.53%）和羥脯氨酸（9.25%）。然而，并未在ASC中檢測到半胱氨酸。該結果與Lin等[9]測定的大目金槍魚PSC的氨基酸含量一致。此外，高含量的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸與膠原中發生頻率高的甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸序列一致，該序列對于三螺旋的形成至關重要。ASC中亞氨基酸的含量為19.78%，該含量與來源于海蜇的膠原蛋白（19.50%）[10]、鯉魚魚鱗或魚骨膠原蛋白（19.20%）[11]中的亞氨基酸含量類似。

圖2 大目金槍魚皮ASC的氨基酸組成成分分析

2.3 紅外光譜分析

由圖3可知，ASC含五個特征的酰胺區：酰胺A（3 425.85 cm-1）、酰胺B（2 930.04 cm-1）、酰胺Ⅰ（1 644.73 cm-1）、酰胺Ⅱ（1 545.40 cm-1）和酰胺Ⅲ（1 238.75 cm-1）。ASC產品的酰胺A波長位于3 430 cm-1，這符合自由N—H振動的常見波數[8-9]。ASC產物的酰胺B帶的波長為3 056 cm-1，表明存在不對稱的—CH2延伸。膠原蛋白的酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶與其的三螺旋結構有關。酰胺Ⅰ帶主要與多肽鏈上的C==O伸縮振動或與COO—偶聯的氫鍵相關，來自ASC樣品的酰胺Ⅰ帶在1 600～1 700 cm-1范圍內具有強吸光度[9,12]。酰胺Ⅱ帶代表N—H彎曲振動與C—N伸縮振動耦合，ASC的測量酰胺Ⅱ波長在1 550～1 600 cm-1范圍內。此外，酰胺Ⅲ帶對應于甘氨酸和脯氨酸殘基上的—CH2特征振動。結果表明大目金槍魚皮ASC具有較完整的三螺旋結構。

圖3 大目金槍魚皮ASC的傅里葉變換紅外光譜圖

2.4 重金屬含量分析

為了探究在化妝品或生物醫學領域中使用金槍魚皮膠原蛋白的可行性，使用電感耦合等離子體-質譜法（ICP-MS）分析相關重金屬元素的含量[9]。結果如表1所示：ASC樣品中砷、鉛和汞的含量顯著低于國家標準含量。說明該膠原蛋白具有較好的安全性，具有在化妝品或生物醫學等領域應用的潛力。

表1 大目金槍魚皮ASC的重金屬元素分析

2.5 掃描電鏡分析

掃描電鏡（SEM）常被用于觀察膠原的超微結構和表面積，以評估其潛在應用。采用SEM在100×、500×和2 000×下觀察ASC的超微結構，其結構如圖4所示。在肉眼觀察下，膠原海綿呈白色且結構均勻致密。在SEM圖像中，ASC顯示出均勻且多孔的微觀結構；在更高的放大率下，圖像表明ASC呈現出不規則的致密片狀薄膜，并由隨機長絲連接。形態學結果表明，由大目金槍魚皮制成的ASC海綿具有生物醫學材料的潛力。

圖4 大目金槍魚皮ASC海綿的SEM圖

2.6 細胞毒性和過敏性試驗

采用MTT法和LDH毒性試驗，評價大目金槍魚皮ASC的細胞毒性和致敏性，結果如圖5所示。結果（圖5A）表明，隨著ASC質量濃度的增加，24 h后NIH-3T3成纖維細胞的存活率并沒有降低。此外，ASC產物亦可促進NIH-3T3成纖維細胞的生長，表明ASC在體外沒有明顯的細胞毒性作用。每個人體組織的細胞質中都含有LDH，細胞膜完整性的破壞導致周圍基質中LDH濃度的增加。因此，由于其與過敏反應和炎癥反應密切相關，LDH的釋放被用作評估過敏原性的標準[8-9]。如圖5（B）所示，與未處理的細胞相比，ASC產物存在時細胞的LDH釋放相對較低。結果表明，大目金槍魚魚皮ASC可以作為一種無細胞毒性和低過敏性的生物材料用于化妝品和生物醫學應用。

圖5 大目金槍魚皮ASC的細胞毒性（A）和致敏性（B）評價

3 結論

試驗采用酸法提取大目金槍魚魚皮的酸溶性膠原蛋白（ASC）并研究其相關的理化特性、細胞毒性和致敏性。SDS-PAGE結果初步判斷大目金槍魚魚皮ASC主要以I型膠原蛋白為主。ASC富含甘氨酸（19.73%）、谷氨酸（9.37%）、丙氨酸（8.87%）、精氨酸（7.40%）、脯氨酸（10.53%）和羥脯氨酸（9.25%）。FITR結果表明ASC仍有完整的三股螺旋結構。重金屬含量均低于中國的標準含量。通過細胞毒性和過敏性試驗，表明ASC無細胞毒性和低過敏性。研究表明來源于大目金槍魚魚皮ASC具有作為化妝品添加劑和生物醫用材料應用的潛力。