丙烯酰胺檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)分析

馮建立，王麗杰，王學(xué)軍*

1. 中國(guó)平煤神馬集團(tuán)煉焦煤資源開發(fā)及綜合利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（平頂山 467000）；2. 開封華瑞化工新材料股份有限公司（開封 475000）

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一種人工合成的典型的α,β-不飽和酰胺分子，被廣泛用作有機(jī)合成的原料，目前90%的丙烯酰胺用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺是最重要的水溶性合成高分子材料之一，被廣泛應(yīng)用于水處理、石油開采、造紙、選礦和制糖等眾多工業(yè)領(lǐng)域。后來，AA在一些高溫加工的食物中被發(fā)現(xiàn)，因具有神經(jīng)毒性并可能使人類致癌，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）于1994年將其定為二類致癌物[1]。經(jīng)過多年的深入研究，人們對(duì)AA毒性及機(jī)理才逐步有了更清晰、更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。該文簡(jiǎn)要介紹AA的環(huán)境暴露與毒性，梳理分析AA相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)制修訂工作提出具體的建議。

1 AA的環(huán)境暴露與毒性

AA在多行業(yè)的大量使用促進(jìn)了工業(yè)的發(fā)展，但也通過不同途徑進(jìn)入水體、土壤和大氣等環(huán)境介質(zhì)甚至生物體內(nèi)，進(jìn)而對(duì)環(huán)境及人體健康產(chǎn)生影響[2]。生活飲用水是人體攝入AA的主要來源之一。然而，研究表明AA進(jìn)入人體最重要的途徑還是食品攝入[3]。

很多食品在高溫（＞120 ℃）烹飪時(shí)產(chǎn)生的“非酶褐變”現(xiàn)象，實(shí)際上是還原糖類（如葡萄糖）與氨基化合物（如氨基酸、蛋白質(zhì)）之間的美拉德（Maillard）反應(yīng)[4]，經(jīng)過復(fù)雜的多級(jí)過程，最后以一種棕色或者是黑色的大分子物質(zhì)展現(xiàn)。一般認(rèn)為，美拉德反應(yīng)中天冬酰胺和葡萄糖的反應(yīng)是形成AA的重要途徑（圖1）。因此，煎炸、烘烤高淀粉類食品（馬鈴薯、咖啡等）會(huì)產(chǎn)生非常誘人的色澤及風(fēng)味[5]，增加人們食欲的同時(shí)也產(chǎn)生了AA。

圖1 食品加工中AA的典型形成途徑

AA具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性、生殖毒性和潛在致癌性，可通過皮膚、呼吸道、消化道和胎盤進(jìn)入生物體內(nèi)并蓄積，危害人類健康[6]。隨著飲食安全事件不斷發(fā)生，各國(guó)政府和國(guó)際組織出臺(tái)了多項(xiàng)關(guān)于AA的法律法規(guī)，如世界衛(wèi)生組織規(guī)定飲用水中AA最大允許殘留量為0.5 μg/L。歐盟《物質(zhì)和混合物分類、標(biāo)簽和包裝法規(guī)指南》規(guī)定AA的最大限量為1 000 mg/L。中國(guó)規(guī)定飲用水及地表水源地中AA標(biāo)準(zhǔn)限值為0.5 μg/L。這些法規(guī)的出臺(tái)和實(shí)施為減少丙烯酰胺的環(huán)境危害提供了法律依據(jù)和保障，也為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了契機(jī)。

2 AA相關(guān)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

2.1 AA相關(guān)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

表1列出了AA相關(guān)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。目前唯一涉及AA檢測(cè)的ISO標(biāo)準(zhǔn)是ISO 18862：2016《咖啡和咖啡制品 丙烯酰胺的測(cè)定 衍生后使用HPLC-MS/MS和GC-MS法》，由ISO食品技術(shù)委員會(huì)歸口制訂。這可能與咖啡在世界貿(mào)易中的重要地位有關(guān)[7]：咖啡是交易最廣泛的農(nóng)產(chǎn)品之一，也是世界三大飲品之一。

表1 AA相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)

另外15項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)皆是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB），其中GBZ表示職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。在15項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，有6項(xiàng)強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，9項(xiàng)推薦性標(biāo)準(zhǔn)。按照中華人民共和國(guó)食品安全法（2018修正）第二十五條的規(guī)定：食品安全標(biāo)準(zhǔn)是強(qiáng)制執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)。除食品安全標(biāo)準(zhǔn)外，不得制定其他食品強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。因此，食品安全標(biāo)準(zhǔn)是強(qiáng)制執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)。

這些標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了不同對(duì)象或環(huán)境中AA含量的測(cè)試方法和要求，包括氣相色譜（GC）法、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜（LC、HPLC）法和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）等。值得注意的，除了含量，GB/T 34405—2017和GB 31604.18—2016中還涉及了遷移量的概念。遷移量在食品中主要用于考察從包裝品遷移至食品中的潛在能力以及遷移物質(zhì)的有無毒性。GB 4806.1—2016中遷移量的定義為：從食品接觸材料及制品中遷移到與之接觸的食品或食品摸擬物中的某種或某類物質(zhì)的量[8]。通過假設(shè)包裝材料中存在的某種物質(zhì)會(huì)完全遷移到食物中，從而可以計(jì)算出潛在遷移的最嚴(yán)重情況。

2.2 AA相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

已備案行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有6項(xiàng)，包括1項(xiàng)環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)（HJ 697—2014）、1項(xiàng)化工標(biāo)準(zhǔn)（HG/T 5375—2018）、4項(xiàng)出入境檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 4031—2014、SN/T 2844—2011、SN/T 2401—2009和SN/T 2096—2008）等，分別規(guī)定了水質(zhì)、水性膠粘劑、化妝品、紡織品、玩具和食品中AA的檢測(cè)方法。

2.3 AA相關(guān)的地方標(biāo)準(zhǔn)與團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

現(xiàn)行AA相關(guān)的地方標(biāo)準(zhǔn)有5項(xiàng)，包括3項(xiàng)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（DB21/T 3110—2019、DB61/T 563—2013和DB37/T 4145—2020）、1項(xiàng)食品用包裝材料及制品標(biāo)準(zhǔn)（DB13/T 1081.10—2009）和1項(xiàng)紙巾紙和濕紙巾（DB44/T 1821—2016）方面的標(biāo)準(zhǔn)。

目前僅有一項(xiàng)相關(guān)的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/ZSSP 0008—2020焙烤食品中丙烯酰胺的減量控制指南，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了焙烤食品中丙烯酰胺的減量控制的術(shù)語和定義、生產(chǎn)過程控制要求和包裝、運(yùn)輸、貯存及銷售的要求，適用于焙烤食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)預(yù)防和減少焙烤食品中丙烯酰胺形成的控制操作。

3 討論與建議

3.1 AA相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法匯總

通過檢索整理，截至到2021年5月，涉及AA的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)共26項(xiàng)，其中國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)14項(xiàng)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)6項(xiàng)、地方標(biāo)準(zhǔn)5項(xiàng)、團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)。上述標(biāo)準(zhǔn)中，直接涉及AA含量或遷移量測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)有24項(xiàng)，如表2所示。

表2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中AA測(cè)定方法統(tǒng)計(jì)

3.2 AA的提取和凈化

丙烯酰胺為極性分子，一般采用水或極強(qiáng)有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。水是目前使用最廣泛的溶劑，分為冷提取和熱提取。上述標(biāo)準(zhǔn)中使用的有機(jī)溶劑體系有甲醇、水-甲醇、異丙醇-水-乙醇、丙酮、水-正已烷、乙酸乙酯等。有機(jī)溶劑提取體系可將包埋在塑料、脂肪中的AA完全提取出來，且便于濃縮。對(duì)于富含蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪和色素等物質(zhì)的樣品，需額外進(jìn)行凈化處理（如石墨化碳黑層析柱），再進(jìn)行丙烯酰胺含量的測(cè)定。

對(duì)于水質(zhì)樣品，包括生活飲用水及其水源水，相關(guān)的4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)主要采用采樣瓶采集樣品、濾膜過濾，并用固相萃取技術(shù)富集樣品中的丙烯酰胺；對(duì)于固體樣品，包括咖啡、玩具、食品、紙巾和包裝塑料等，一般采用水或混合溶劑浸泡提取、固相萃取柱富集結(jié)合濾膜凈化的方法；對(duì)于氣體樣品，目前只有職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GBZ/T 160.62—2004，規(guī)定采用沖擊式吸收管采集，溴化后乙酸乙酯萃取的方法制備樣品溶液。

3.3 AA的測(cè)定方法

3.3.1 滴定法

目前相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)中，只有GB/T 22312—2008標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了滴定法作為一種備選方法：在試樣溶液中加入過量的溴酸鉀-溴化鉀溶液，在酸性介質(zhì)中溴酸鉀和溴化鉀反應(yīng)生成的溴與試樣中丙烯酰胺的雙鍵加成。反應(yīng)完成后，加入過量的碘化鉀還原未反應(yīng)的溴而生成碘，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴析出的碘。

滴定法簡(jiǎn)單便捷，不需要特殊設(shè)備和對(duì)照品，但專屬性差。尤其是樣品雜質(zhì)多的話，滴定所受主觀因素影響太大。特別是對(duì)于痕量物質(zhì)的檢測(cè)，比如環(huán)境及水質(zhì)中AA濃度較低且易受到其他物質(zhì)干擾的有害雜質(zhì)檢測(cè)，在有好的對(duì)照品的情況下，色譜法精密度和專屬性均可，更有優(yōu)勢(shì)。

3.3.2 氣相色譜法

GC法要求分析對(duì)象須有一定的熱穩(wěn)定性和可揮發(fā)性，但AA屬熱不穩(wěn)定的有機(jī)物，且揮發(fā)性低，不能直接用于GC檢測(cè)。通常先利用化學(xué)衍生以增強(qiáng)分子穩(wěn)定性，進(jìn)而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性。溴化衍生是AA常用的衍生方法。其中采用溴化鉀與溴酸鉀生成的新生溴參與溴化衍生，比溴水衍生在操作方面更為安全可靠，所需時(shí)間也相對(duì)較短。

GC法所用的檢測(cè)器一般有火焰離子化檢測(cè)儀（FID）、紫外檢測(cè)儀（UV）和電子俘獲檢測(cè)器（ECD）等。相比之下，氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)具有更低的檢出限、更高的靈敏度，是普遍采用的AA檢測(cè)手段之一，如出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2096—2008《食品中丙烯酰胺的檢測(cè)方法 同位素內(nèi)標(biāo)法》使用同位素標(biāo)記的GC-MS內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)油炸和焙烤食品中的AA，測(cè)定低限為5 ng/g（即5 ppb）。

3.3.3 液相色譜法

液相色譜法是痕量分析物檢測(cè)中普遍的方法，其樣品不需要進(jìn)行衍生化。目前液相色譜的檢測(cè)器主要有UV和二極管列陣（DAD）檢測(cè)器。UV檢測(cè)器可以在特定波長(zhǎng)工作，回收率高、精密度好、重復(fù)性好。但丙烯酰胺缺乏芳環(huán)、共軛雙鍵等生色基團(tuán)和自然熒光，使得紫外檢測(cè)器的響應(yīng)不靈敏，選擇性較差。DAD檢測(cè)器本質(zhì)上也是紫外檢測(cè)器，可以得到時(shí)間、光強(qiáng)和波長(zhǎng)的三維圖譜。但因?yàn)槭侨ㄩL(zhǎng)掃描，與UV相比，DAD在靈敏度方面有所損失。

液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（包括LC-MS、HPLC-MS、HPLC-MS/MS等）技術(shù)是國(guó)際上主要采用的檢測(cè)食品中丙烯酰胺的方法之一，通常通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）或選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式進(jìn)行[9]。我國(guó)GB 5009.904—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙烯酰胺的測(cè)定》推薦使用穩(wěn)定性同位素稀釋的LC-MS/MS方法作為AA的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，即采用該模式。該方法定量限為10 μg/kg（即10 ppb），具有極高靈敏度，適用于食品中痕量、超痕量丙烯酰胺的檢測(cè)。

3.4 AA測(cè)定方法發(fā)展趨勢(shì)

3.4.1 樣品預(yù)處理

衍生化處理是GC法分析需要攻克的重點(diǎn)，溴化衍生對(duì)操作者人身安全的影響以及衍生化程度、有可能帶入新干擾物質(zhì)等受到質(zhì)疑，今后發(fā)展無需衍生亦能滿足GC分析的前處理方法是重要課題之一[10]。除去AA提取液中的干擾物，通常用固相微萃取技術(shù)來純化提取液[11]。針對(duì)AA開發(fā)出特異性吸附材料可以提高選擇性吸附效率。有研究者[12]通過合成仿生分子印跡材料作為固相萃取填料，作為一種新興的樣品預(yù)處理手段在AA的分析中具有良好的應(yīng)用前景[13]。AA的分離與富集需開發(fā)更簡(jiǎn)便、高效的方法，其中自動(dòng)化和微量化是未來技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)[14]。

3.4.2 檢測(cè)方法

液相色譜、氣相色譜及其與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)是當(dāng)今國(guó)際用來檢測(cè)丙烯酰胺含量的常用方法，這些方法雖然選擇性好、結(jié)果可靠，但是儀器相對(duì)昂貴，加標(biāo)回收率相對(duì)較低。為保證食品快速評(píng)價(jià)工作科學(xué)合理、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，2017年國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局組織制定了《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，為開發(fā)AA快速檢測(cè)方法提供了標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。許多新興的分析方法[15-16]已展現(xiàn)出在快速檢測(cè)方面的應(yīng)用潛力，但如何選擇合適的技術(shù)并納入標(biāo)準(zhǔn)體系中來還有許多工作要做。

3.4.3 檢測(cè)范圍

在檢測(cè)方面，目前國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)比國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)涵蓋的范圍更廣泛，包括水質(zhì)、空氣、食品和化妝品等一些主要的商品，但有些方面尚未涉及，如對(duì)土壤和海洋環(huán)境中AA的測(cè)定幾乎沒有涉及。土壤和海洋與人類的生存環(huán)境息息相關(guān)，AA對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的影響不容忽視。加強(qiáng)環(huán)境中AA的跟蹤監(jiān)測(cè)也需要標(biāo)準(zhǔn)先行，包括土壤、海洋、行業(yè)污水、水生物等。

3.4.4 制定AA減量指南

油炸、烘焙等高溫加工食品的無處不在及聚丙烯酰胺的廣泛應(yīng)用對(duì)AA的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提出了更高的要求，同時(shí)也需要從AA的減量控制方面著手以盡量減少和抑制AA對(duì)人類健康的不利影響。很多國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)發(fā)布了減少AA含量的指引。目前國(guó)內(nèi)僅有一項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了焙烤食品中AA的減量控制指南，而全國(guó)性的減量指南仍然缺失。建議從AA的主要來源入手，有效控制AA的排放與擴(kuò)散，對(duì)其控制應(yīng)為技術(shù)可以達(dá)到的最低濃度。因飲用水中AA的主要來源是作為絮凝劑或助凝劑添加的聚丙烯酰胺，所以應(yīng)開發(fā)環(huán)保型聚合物[17-18]，控制聚合物中AA的單體含量，且在不影響絮凝效率和效果的情況下，聚丙烯酰胺投加量越少越好。

4 結(jié)語與展望

國(guó)內(nèi)已經(jīng)基本建立起食品、商品及環(huán)境中丙烯酰胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系，包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)等。應(yīng)進(jìn)一步研究和完善相關(guān)的樣品處理技術(shù)、富集凈化技術(shù)以及開發(fā)新的分析測(cè)試技術(shù)，使丙烯酰胺檢測(cè)技術(shù)朝著成本低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)分析和快速檢測(cè)的方面發(fā)展，同時(shí)通過標(biāo)準(zhǔn)宣貫，加強(qiáng)對(duì)丙烯酰胺的常規(guī)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，嚴(yán)格相關(guān)行業(yè)丙烯酰胺污水排放標(biāo)準(zhǔn)，盡可能減少丙烯酰胺向環(huán)境中的排放，保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類健康。