HPLC法同時(shí)測(cè)定蕎麥中8種酚酸類成分

陳清艷

上海旺旺食品集團(tuán)有限公司（上海 201103）

蕎麥?zhǔn)寝た剖w麥屬一種草本植物，是一種生育期短，耐貧瘠、適應(yīng)性廣泛的雜糧作物。蕎麥含有多酚類天然植物活性成分，主要包括黃酮類、酚酸類和醌類化合物，其中酚酸是一類含有酚環(huán)的有機(jī)酸，主要是原兒茶酸和對(duì)羥基苯甲酸等。研究表明多酚具有降血糖、降血脂、降血壓、抗癌防癌、抗炎和抗氧化等生理活性[1-3]。

多酚類物質(zhì)的檢測(cè)方法，目前主要有分光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法[4]、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、核磁共振法等。分光光度法測(cè)定的是總酚類物質(zhì)；薄層色譜法操作繁瑣、重現(xiàn)性差；具體多酚類成分分析和鑒定主要依靠液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[7-8]或核磁共振等方法進(jìn)行，設(shè)備昂貴，在一定程度上限制了這些方法的應(yīng)用；高效液相色譜法仍是目前用來(lái)定量多酚類化合物最有效的一種方法。但多酚類化合物的檢測(cè)研究多集中在黃酮類物質(zhì)如蘆丁、槲皮素、山奈酚等[9-12]，對(duì)于酚酸類化合物的具體檢測(cè)方法研究的較少。試驗(yàn)采用高效液相色譜法（二極管陣列檢測(cè)器）測(cè)定蕎麥中的8種酚酸類成分，并對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜，二極管陣列檢測(cè)器（安捷倫）；XS205分析天平（美國(guó)梅特勒-托利多）；ELGA Classic UV超純水機(jī)（英國(guó)ELGA）；Sigma2-16P離心機(jī)（西格瑪）；漩渦混合儀（上海皓莊）；超聲波清洗儀（上海安譜）；旋風(fēng)顆粒粉碎機(jī)（福斯）；氮吹儀（上海安譜）。

1.1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品：沒食子酸（99.0%，CAS號(hào)：149-91-7）、原兒茶酸（99.0%，CAS號(hào)：99-50-3）、對(duì)羥基苯甲酸（99.0%，CAS號(hào)：99-96-7）、香草酸（99.0%，CAS號(hào)：121-34-6）、咖啡酸（99.0%，CAS號(hào)：331-39-5）、丁香酸（99.0%，CAS號(hào)：530-57-4）、P-香豆酸（98.0%，CAS號(hào)：501-98-4）、阿魏酸（99.0%，CAS號(hào)：1135-24-6），J & K，購(gòu)自百靈威。

試劑：甲醇（色譜純，Merck）；甲酸（色譜純，Merck）。

試驗(yàn)用水均為經(jīng)超純水機(jī)處理后的水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

前處理：將蕎麥顆粒（寧夏新野提供）粉碎，稱取2 g（精確至0.000 1 g）粉末至50 mL離心管中，加入70%甲醇溶液至25 mL刻度，渦旋5 min，超聲10 min，按6 000 r/min離心10 min，快速濾紙過(guò)濾，用70%甲醇定容至25 mL。稱取2份樣品，按上述操作，液體合并備用。

待測(cè)液：取10 mL上述備用液體至10 mL容量瓶中，在40 ℃下氮吹至近干（約剩原體積的1/3），用0.1%甲酸復(fù)溶至10 mL，混勻，過(guò)膜，待測(cè)。

基質(zhì)加標(biāo)液：將25 mL上述備用液體進(jìn)行40 ℃氮吹，至剩余液體約7～8 mL時(shí)，取下，用0.1%甲酸復(fù)溶至25 mL，過(guò)膜，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）：稱取適量（精確至0.1 mg）各標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL棕色容量瓶中，分別用色譜純甲醇溶解后定容，混勻，置于-4 ℃下密封保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（50 μg/mL）：依次吸取0.5 mL單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，在40 ℃水浴下氮吹干，用1.2.1小節(jié)制備好的基質(zhì)加標(biāo)液復(fù)溶后定容。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（基質(zhì)加標(biāo)法）

依次從1.2.2小節(jié)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（50 μg/mL）中吸取0.08，0.2，0.4，0.6和0.8 mL分別于2 mL容量瓶中，用1.2.1小節(jié)制備好的基質(zhì)加標(biāo)液定容，制作成2，5，10，15和20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，過(guò)膜，待測(cè)。

蕎麥HPLC色譜圖（8種目標(biāo)物混標(biāo)圖譜及蕎麥樣品加標(biāo)圖譜）詳見圖1和圖2。

圖1 8種目標(biāo)物混標(biāo)圖譜

圖2 蕎麥樣品加標(biāo)圖譜

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm和300 nm；流動(dòng)相配比及梯度洗脫時(shí)間見表1。

表1 流動(dòng)相配比及梯度洗脫時(shí)間

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，試驗(yàn)所測(cè)的8個(gè)酚酸類物質(zhì)具有相似的UV光譜，分別在末端和 280 nm有最大和次高吸收，由于樣品中8個(gè)化合物的靈敏度不同，為了便于準(zhǔn)確定量，選擇250 nm和300 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 提取溶劑的選擇

分別用80%丙酮[14]、70%甲醇、80%甲醇[5-6]、100%甲醇進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，甲醇試劑提取效果優(yōu)于丙酮，70%～100%甲醇提取效果基本無(wú)差異，綜合考慮，選取70%甲醇為此次試驗(yàn)提取溶劑。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制試劑的選擇

8種標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇溶解配制，因發(fā)現(xiàn)純甲醇標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)雜峰狀態(tài)，故選取（1）甲醇、（2）70%甲醇水溶液、（3）乙腈、（4）0.1%甲酸水溶液分別測(cè)試。將標(biāo)準(zhǔn)品氮吹至近干后，以相應(yīng)溶劑稀釋后進(jìn)標(biāo)，溶劑（1）、溶劑（2）、溶劑（3）出現(xiàn)峰形均前沿和拖尾，無(wú)法改善，使用溶劑（4）后，峰形改善，推斷甲醇及乙腈含量過(guò)多會(huì)使峰形變化，最終選用0.1%甲酸水溶液復(fù)溶稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及復(fù)溶樣品后待上機(jī)測(cè)試。

2.1.4 流動(dòng)相的選擇

分別選取（1）水-甲醇-乙腈[13]、（2）甲酸酸化的甲醇-乙腈[14]、（3）甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液、（4）0.1%甲酸-甲醇-乙腈進(jìn)行目標(biāo)峰測(cè)試。在條件（1）、條件（2）、條件（3）中色譜峰峰形差且有些目標(biāo)物未出峰，條件（4）目標(biāo)物完全分離且峰形較好，最終確定以0.1%甲酸-甲醇-乙腈為此次試驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.2 線性范圍

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用HPLC（雙波長(zhǎng)）分別測(cè)其峰面積，8種目標(biāo)化合物在2～20 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度和峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999以上。波長(zhǎng)、峰面積、線性方程及相關(guān)系數(shù)詳見表2。

表2 混標(biāo)之峰面積及相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率及精密度試驗(yàn)

稱取樣品，在2個(gè)添加水平下加標(biāo)，按1.2.1小節(jié)處理，加標(biāo)回收率及精密度見表3。結(jié)果顯示，在2個(gè)添加水平下目標(biāo)物樣品平均加標(biāo)回收率分別在71.97%～96.94%和82.62%～97.36%之間，SRSD＜ 7.64%，能滿足定量檢測(cè)的要求，詳見表3。

表3 樣品回收率和精密度（n=6）

2.4 檢出限和定量限

吸取加標(biāo)樣品（50 μg添加水平）重復(fù)進(jìn)樣10次，以3倍信噪比及10倍信噪比計(jì)算，得出檢出限及定量限，詳見表4。

表4 各目標(biāo)物的檢出限和定量限

3 結(jié)論

上述方法使用高效液相色譜分離系統(tǒng)，梯度洗脫進(jìn)行8種酚酸類成分的測(cè)定，采用基質(zhì)加標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可有效提取目標(biāo)物。該方法分離效果良好，峰形尖銳，且定量分析準(zhǔn)確可行。此方法適用于蕎麥中同時(shí)測(cè)定8種酚酸類成分。酚酸類物質(zhì)對(duì)蕎麥的功能性影響及其對(duì)人體的保健功能待進(jìn)一步的數(shù)據(jù)累積及深入研究。