陰離子交換色譜測定乳粉中2’-巖藻糖基乳糖

喻斌斌，葉文慧，劉彪

內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團(tuán)股份有限公司（呼和浩特 010110）

母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳中的第三大固體組分，僅次于乳糖和脂肪，HMOs除了為新生兒提供營養(yǎng)之外，還可以選擇性地促進(jìn)有益細(xì)菌在腸道中的生長，防止病原性細(xì)菌的粘附，調(diào)節(jié)嬰幼兒的免疫系統(tǒng)，從而降低新生兒的患病風(fēng)險[1-2]。其中2’-FL含量最高，為0.76～4.78 g/L[3-4]，約占分泌型母親HMOs總量的30%[5]。

牛乳中低聚糖的含量約為成熟母乳的1/20[6]，羊乳中低聚糖含量很少，僅為0.25～0.30 g/L[7]。嬰幼兒配方乳粉基粉主要是牛乳和羊乳，在嬰幼兒配方食品中添加適量的HMOs成分是實現(xiàn)母乳化的重要標(biāo)志。在開發(fā)含HMOs配方的過程中，必須開發(fā)出測定嬰幼兒配方乳粉成品中HMOs含量的方法，除了用于標(biāo)簽符合性的質(zhì)量控制外，還用于確認(rèn)耐受性、安全性、有效性試驗的產(chǎn)品中的HMOs水平，并確保嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)過程中的HMOs含量穩(wěn)定性[8]。

目前HMOs的定量測定方法有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[9-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）法[12-14]、核磁（nuclear magnetic resonance，NMR）法[15]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[16-18]等。但大多數(shù)方法測定的目標(biāo)樣本是母乳，嬰幼兒配方乳粉中2’-FL的含量水平遠(yuǎn)低于乳糖，檢測時受乳糖干擾明顯，同時還有其他糖類及蛋白質(zhì)等的干擾。HPLC法需對樣品進(jìn)行衍生，操作繁瑣且重復(fù)性較差；LC-MS法在乳品復(fù)雜的基質(zhì)下回收率不理想，并且很難找到合適的內(nèi)標(biāo)消除誤差；NMR法靈敏度較差[19]。而IC法具有無需衍生、操作簡便、分離度好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[20]，更加高效、快速和準(zhǔn)確。此次試驗建立了采用高效陰離子交換色譜-脈沖電化學(xué)檢測法（HPAEC-PAD）對嬰幼兒配方乳粉中2’-FL進(jìn)行定量的檢測方法，并在嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)中進(jìn)行方法學(xué)驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICS-3000離子色譜儀，配電化學(xué)檢測器，賽默飛世爾科技公司；超聲波清洗器，湖北鼎泰高科有限公司；漩渦振蕩器，德國IKA；分析天平，梅特勒-托利多；定量比色管，北玻；容量瓶，天玻；凈化柱，賽默飛世爾科技公司，Dionex OnGuard II RP Cartridges；注射器，探索精選；0.45 μm濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

2’-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，CAS：41263-94-9，純度90.0%，英國Carbosynth公司；甲醇，色譜純；50%氫氧化鈉；磺基水楊酸，優(yōu)級純；試驗用水，超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2’-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.5 mg/mL）的配制：稱取5 mg 2’-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10 mL，計算時校正純度。

2’-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的配制：將2’-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋制備一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為0.25，0.5，1.25，2.5，5，10和20 μg/mL。臨用前配制。

1.2.2 樣品前處理

稱取0.4 g左右（精確到0.1 mg）乳粉樣品于100 mL定量比色管中，加入40 mL水溶解，于漩渦振蕩器振搖2 min充分混勻，加入20 mL 3%磺基水楊酸溶液，加水定容至刻度后搖勻，超聲波超聲提取10 min。搖勻后定性濾紙過濾。

活化凈化柱，使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水進(jìn)行活化，放置0.5 h后使用。

試樣溶液依次通過0.45 μm濾膜和凈化柱，棄去前面2倍柱體積濾液，收集后面的濾液上機(jī)測定。

1.2.3 儀器條件

離子色譜柱：賽默飛DIONEX CarboPacTM PA1柱，4 mm×250 mm，10 μm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；淋洗液：A為去離子水，B為200 mmol/L NaOH水溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.1及Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品沉淀劑的選擇

比較使用0.15%乙酸、60%乙醇、3%磺基水楊酸溶液沉淀蛋白的效果。除沉淀劑不同外，其他均按1.2方法進(jìn)行操作。各預(yù)處理方法的樣品測定分析結(jié)果見表2。結(jié)果表明，磺基水楊酸沉淀法對于乳粉中蛋白的沉淀效果最好。因此，選用3%磺基水楊酸溶液作為此次試驗的沉淀劑。

表2 不同預(yù)處理方法下樣品測定分析結(jié)果對比表

2.2 色譜條件的選擇

離子色譜的流動相中，洗脫能力強(qiáng)弱順序：NaAc溶液＞NaOH溶液＞水。通過在陰性乳粉中添加2’-FL標(biāo)準(zhǔn)品，對比分別使用NaAc溶液-NaOH溶液-水體系（圖1）和NaOH溶液-水體系（圖2）進(jìn)行洗脫的效果，兩種方法均使用最優(yōu)洗脫梯度條件。圖1中陰性乳粉在2’-FL目標(biāo)峰附近有雜峰，導(dǎo)致加標(biāo)后樣品2’-FL目標(biāo)峰出現(xiàn)駝峰現(xiàn)象，而圖2中2’-FL目標(biāo)峰峰型標(biāo)準(zhǔn)，不受乳粉基質(zhì)中其他物質(zhì)干擾。結(jié)果表明，NaOH溶液-水體系的洗脫效果更優(yōu)。

圖1 使用NaAc溶液-NaOH溶液-水體系洗脫的樣品色譜圖

圖2 添加2’-FL的乳粉樣品色譜圖

2.3 線性范圍、定量限及精密度

準(zhǔn)確吸取2’-FL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.223 2，0.446 4，1.116，2.232，4.464，8.928和17.856 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以2’-FL工作液峰面積為橫坐標(biāo)，對應(yīng)工作液濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=0.886 4X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表明2’-FL在0.223 2～17.856 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

稱取適量陰性乳粉樣品，進(jìn)行加標(biāo)。按照1.2方法前處理后上機(jī)，測定回收率，結(jié)果得到添加量為50 mg/100 g樣品平均回收率為85.7%，加標(biāo)量為100 mg/100 g樣品平均回收率為90.5%。當(dāng)給定的加標(biāo)量得到的回收率在90%～110%之間時，該加標(biāo)量可以作為方法的定量限，即該方法定量限為100 mg/100 g。

準(zhǔn)確稱取3份陰性乳粉樣品，選取3個加標(biāo)水平，每個加標(biāo)水平測定3個平行。2’-FL加標(biāo)量分別為205，308和411 mg/100 g。結(jié)果得到回收率在93.98%～ 99.35%，加標(biāo)回收率的SRSD為0.30%～1.65%，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)在此濃度范圍內(nèi)的要求[21]。驗證結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.4 實際樣品檢測

按照該方法的前處理和試驗條件對實際乳粉樣品檢測測定，結(jié)果見表4。SRSD為0.92%～5.76%。說明該方法對檢測實際乳粉中2’-FL具有可靠性和實用性。

表4 含有2’-FL乳粉樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

試驗建立了高效陰離子交換色譜-脈沖電化學(xué)檢測法定量檢測嬰幼兒配方乳粉中2’-FL的方法。該方法樣品預(yù)處理過程無需衍生、還原或分離純化，操作簡便，分離度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，適用于嬰幼兒配方乳粉中2’-FL的檢測分析，為精確定量嬰幼兒配方乳粉中2’-FL、開發(fā)含2’-FL的嬰幼兒配方乳粉提供可靠的技術(shù)支持，對工業(yè)上批量化檢測2’-FL具有很好的應(yīng)用價值。