UPLC-MS/MS測定稻谷、大豆、芥菜、金桔中氟唑菌酰胺殘留量

歐陽小艷，劉曉琴，肖艷*

1. 南寧市疾病預防控制中心（南寧 530023）；2. 廣電計量檢測（南寧）有限公司（南寧 530007）

氟唑菌酰胺（fluxapyroxad）具有羧酰胺類結構（圖1），其作用方式是通過抑制線粒體呼吸鏈中的復合物Ⅱ中的琥珀酸脫氫酶，從而抑制孢子發芽、芽孢管和菌絲體生長及孢子的形成，達到防治和治療真菌病害的目的[1-2]。氟唑菌酰胺于2011年在英國上市，由于其具有效果好、持久、廣譜抗菌，且兼具預防和治療的優點，現已被廣泛用于糧谷類、豆類、蔬菜和水果等多種作物中[3-4]。

圖1 氟唑菌酰胺的結構式

隨著氟唑菌酰胺的推廣和使用，歐盟、美國、日本等先后制定其在水果、蔬菜、糧谷和畜產品等食品農殘品中的最大允許殘留量（MRL）。我國在GB 2763《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》上規定氟唑菌酰胺在谷物、油料和油脂、蔬菜和水果等作物中的最大殘留限量，但還沒有出臺關于氟唑菌酰胺檢測的國家標準或地方標準，因此對氟唑菌酰胺的檢測進行研究并建立相關檢測標準以保障食品安全具有重要的現實意義。檢測氟唑菌酰胺的報導多為采用氣相色譜-質譜聯用儀及液相色譜儀進行檢測，如：崔淑華[5]報道一種氟唑菌酰胺酰胺殘留量的GCEI-MS測定方法；劉磊等[6]采用固相萃取-高效液相色譜法檢測草莓中的氟唑菌酰胺殘留量，而使用高效液相色譜-串聯質譜法用于檢測蔬菜和水果類，同時亦能檢測糧谷和油脂類作物中的氟唑菌酰胺的報導較少。

試驗在較為成熟的QuEChERS方法基礎上進行優化，結合超高效液相色譜-串聯質譜法用于稻谷、大豆、芥菜及金桔中的氟唑菌酰胺殘留量的測定，方法簡單易操作、干擾少、靈敏度高、檢出限低、檢測速度快，能完全滿足稻谷、大豆、芥菜、金桔等基質中的氟唑菌酰胺的快速檢測和確證，為氟唑菌酰胺在不同基質上的殘留量的檢測提供科學依據，對保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

超高效液相-三重四極桿串聯質譜聯用儀（QSight? LX-50美國PE公司）；Venusil MP C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，3 μm，phenomenex，USA），V 2 S025渦旋混合器（德國IKA公司）；LD5-2B低速離心機（北京京立離心機有限公司）。

乙腈為色譜純；QuEChERS萃取鹽包[含4 g無水Na2SO4和1 g NaCl，貨號G7750.10001，安捷倫科技（中國）有限公司]；氟唑菌酰胺標準品（純度99.50%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18，40～60 μm）、石墨化炭黑（Carbon-GCB）（均購自上海安譜試驗科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取及凈化

將待測樣品用食品粉碎機打碎。稱取5 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加20 mL乙腈，渦旋混勻2 min，加入QuEChERS萃取鹽包（4 g 無水Na2SO4和1 g NaCl），渦旋混勻，以4 000 r/min離心5 mim，取上清液5 mL過凈化管（含0.3 g PSA和0.3 g C18粉末），渦旋混勻后，取上清液過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 質譜條件

電噴霧電離源（ESI），負離子電離模式（ESI-），ESI噴霧電壓4.6 kV，離子源溫度450 ℃，熱表面誘導去溶劑質譜接口溫度280 ℃，采用多反應監測模式（MRM）。2個離子對380.2＞248.1（入口電壓39 V，碰撞室入口電壓84 V，碰撞能量32 V）和380.2＞131.1（入口電壓38 V，碰撞室入口電壓96 V，碰撞能量35 V），以響應值最高的離子對380.2＞131.1進行定量分析。

1.2.2.2 色譜條件

柱溫35 ℃，進樣體積10 μL，以含0.1%甲酸的3 mmol/L甲酸銨溶液（A）和乙腈（B）為流動相，梯度洗脫條件為：0～2.30 min，60% A～40% B；2.30～ 4.00 min，5% A～95% B；4.00～4.10 min，60% A～40% B；流速0.3 mL/min。

2 結果與分析

2.1 凈化條件優化

選取稻谷、大豆、芥菜、金桔這幾種基質較復雜的試樣作為研究對象，試驗前處理過程簡單易操作：采用乙腈作為提取液，加入萃取鹽包，使水相和有機乙腈層徹底分開。在凈化方式上，優先選擇QuEChERS這一成本較低，操作更簡單的凈化方式。PSA吸附劑為弱陰離子交換填料，能有效去基質中的糖類、脂肪酸等物質；C18吸附劑為硅膠基質鍵合十八烷基填料，具有比表面積大、吸附能力強等優點，能夠較好除去脂類、脂肪等非極性物質；而石墨化炭黑（GCB）主要用于去除色素等物質[7-8]。試驗分別考察0.6 g PSA、0.3 g PSA-0.3 g GCB、0.3 g PSA-0.3 g C18和0.3 g PSA-0.2 g C18-0.1 g GCB這4組QuEChERS試劑對氟唑菌酰胺在稻谷、大豆、芥菜、金桔4種基質中的平均加標回收率情況（n=3）（圖2所示），發現隨著GCB比例提高，氟唑菌酰胺的加標回收率呈下降趨勢，其中0.3 g PSA-0.3 g GCB試驗組中的氟唑菌酰胺平均加標回收率低至30%，說明GCB對氟唑菌酰胺存在一定吸附作用；單獨使用PSA凈化，平均加標回收率為74%～82%，而使用0.3 g PSA-0.3 g C18試劑組的平均加標回收率為78%～100%，回收率較好。綜合考慮，試驗選擇0.3 g PSA-0.3 g C18吸附劑對樣品進行凈化，滿足分析要求。

2.2 方法的線性和檢出限

稱取適量的氟唑菌酰胺，配制成質量濃度1 mg/mL的標準儲備液，用色譜純乙腈稀釋成質量濃度10 μg/mL的標準工作液，檢測時用乙腈稀釋配制成0.01，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50和100 ng/mL系列的溶劑標準溶液。以其定量離子對的峰面積值作為縱坐標，質量濃度（ng/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，其標準曲線方程為y=115 436x+2 846.5，R2=0.998 9，保留時間為2.6 min（圖3所示）。

圖3 2ng/mL氟唑菌酰胺標準溶液的色譜圖和在稻谷、大豆、芥菜和金桔中添加0.010 mg/kg氟唑菌酰胺的色譜圖

方法的檢出限（SLOD）和定量限（SLOQ）分別以最低添加水平0.001 0 mg/kg對應的色譜圖的3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比計算，得出氟唑菌酰胺在稻谷、大豆、芥菜、金桔中的SLOD分別為0.001 0，0.002 0，0.000 50和0.001 0 mg/kg，SLOQ分別為0.003 0，0.006 0，0.001 5和0.003 0 mg/kg。

2.3 基質效應

基質效應是指在提取基質中的目標化合物時，樣品基質中的某些共提取物組分影響目標化合物的離子化，對待測物濃度或質量的測定準確度產生影響，使目標化合物在儀器上的響應發生增強或者抑制的現象。配制系列相同濃度的基質標準溶液來評估方法的線性相關性，各基質曲線如表1所示，通過基質匹配標準溶液與溶劑標準溶液標準曲線的斜率比來判定基質效應，結果表明斜率比值在90%～110%，可判定無基質效應[9-10]，因此可采用溶劑標準曲線進行結果計算。

表1 氟唑菌酰胺在不同基質中的標準曲線和線性系數

2.4 精密度和回收試驗

以稻谷、大豆、芥菜、金桔樣品作為基質，分別添加0.001 0，0.002 0和0.010 0 mg/kg 3組低、中、高3個水平的氟唑菌酰胺，每個添加水平做6個平行試驗，用于考察該方法的回收率和精密度（表2）。其中，氟唑菌酰胺在大豆中的平均加標回收率為75.4%～ 79.2%，加標回收率較低，可能與大豆油脂含量高有關；在稻谷、芥菜和金桔中的平均加標回收率為86.2%～98.7%，加標回收率較好；總體相對標準偏差（SRSD）為1.5%～6.0%，符合農藥殘留分析要求。

表2 氟唑菌酰胺在稻谷、大豆、芥菜、金桔中的加標回收率及相對標準偏差（n=6）

3 結論

試驗通過對前處理方法中的凈化條件、儀器的色譜和質譜條件進行優化，建立稻谷、大豆、芥菜和金桔中氟唑菌酰胺的液相色譜-質譜/質譜檢測方法。結果表明，在0.001 0，0.002 0和0.010 0 mg/kg 3個添加水平下，平均加標回收率為75.4%～98.7%，相對標準偏差為1.5%～6.0%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》要求。該方法雜質干擾小、靈敏度高、檢出限低、適應性廣，能滿足日常檢測需要，為氟唑菌酰胺在不同類型基質上的殘留量的檢測提供重要參考。