西南地區男性不育患者染色體異常的分析研究

姜柯安 景鵬偉 李道云 陳 霞 向葉舟 童珂雅 陳 科*

1.人類胚胎工程重慶市重點實驗室（重慶 400013）；2.重慶市生殖醫學臨床中心（重慶 400013）3.重慶市婦幼保健院，生殖與遺傳研究所（重慶 400013）；4.深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司（深圳 518057）

目前， 全世界約有15%的育齡夫婦存在不孕不育問題， 其中由男性因素導致的不育約占50%[1]。 超過50%的男性不育患者存在無精子癥或少精子癥，其中有15%-30%是由遺傳因素造成的[2]。 染色體異常是導致男性不育的重要原因之一， 正常男性染色體異常的發生率在0.7%-1.0%， 而無精子癥或少精子癥患者可達到10.6%[3]。 無精子因子 (Azoospermia factor,AZF) 位于Yq11 區，AZF 可分 為AZFa、AZFb 和AZFc 三個亞區，該區域的缺失將導致精子發生障礙， 是引起男性不育最常見的遺傳因素[4]。 Y 染色體微缺失在非梗阻性無精癥患者的發生率約為3%-15%，重度少精癥發生率約為6%-8%[5]。 本文主要分析研究西南地區男性不育患者染色體異常的發生率和類型， 探討染色體異常與男性不育的相關性， 為男性不育患者的臨床診斷和治療提供理論依據。

對象與方法

一、研究對象

收集2017 年8 月至2020 年11 月來我院生殖醫學中心就診的男性不育患者3657 例，年齡20-57 歲，平均年齡32.8 歲。 根據患者精液檢查結果將2664 例精子數異?；颊叻譃闊o精子癥組1488 例、 嚴重少精子癥組724 例(精子濃度＜5×106/ml)和少精子癥組452 例(5×106/ml≤精子濃度＜15×106/ml)，將993 例精子數正常(精子濃度≥15×106/ml)的患者設為對照組。 排除經男科醫生檢查診斷為輸精管道梗阻的無精癥患者和輸精管缺如的患者。

二、研究方法

（一）精液常規分析

患者禁欲2-7d，采用手淫法獲取精液于無菌杯中，精液液化后于Makler 板中顯微鏡下進行精子濃度和活力分析；用改良的巴氏染色法進行精子形態分析。所有患者均常規進行至少2 次精液分析檢查， 分析標準參照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版進行。

（二）染色體核型分析

采集患者外周血1.5ml， 常規進行淋巴細胞培養，Giemsa 染色G 顯帶核型分析， 顯微鏡下計數20 個中期分裂相，分析5 個核型。 按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)標準對核型進行描述。

（三）Y 染色體微缺失檢測

采集患者外周血并進行EDTA 抗凝處理， 用廈門致善生物科技有限公司試劑盒提取基因組DNA。 Y 染色體微缺失采用廈門艾德生物醫藥科技有限公司試劑盒進行檢測，該試劑盒采用實時熒光PCR 法，檢測歐洲男科協會(European Academy ofAndrology,EAA)和歐洲分子遺傳實驗質控網 (European Molecular Genetics Quality Network,EMQN) 推薦的六個序列標簽位點，即AZFa 區 的sY84、sY86，AZFb 區 的sY127、sY134 和AZFc 區的sY254、sY255，并選取SRY 和ZFX/ZFY 基因作為內對照同時進行檢測。

三、統計學分析

研究數據采用SPSS 24.0 軟件進行處理，統計分析采用卡方檢驗，P＜0.05 具有統計學意義。

結 果

一、染色體異常核型分析

在2664 例精子數異常的患者中共檢測到染色體核型異常242 例(9.08%)，993 例對照組中共檢出染色體核型異常26 例(2.62%)，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。 在2664 例精子數異常組中性染色體異常189 例 (7.10%)，993 例對照組中 性染色體異常5 例(0.50%)，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)；其中無精子癥組和嚴重少精子癥組性染色體異常檢出率顯著高于對照組(P＜0.05)，而少精子癥組中性染色體異常檢出率和對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)；無精子癥組性染色體異常檢出率顯著高于嚴重少精癥組(P＜0.05)，見表1。 在2664 例精子數異常的患者中常染色體異常53 例 (1.99%)，993 例對照組中常染色 體異 常21 例(2.11%)，兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。 性染色體異常中檢出率最高的類型為47,XXY， 共檢測到145例，占比為74.36%，其中130 例為無精子癥，15 例為嚴重少精子癥。 檢出性染色體嵌合核型5 例，其中3 例表現為無精子癥，2 例為少精子癥。 常染色體異常中檢出率最高的類型為45,XY,rob(13;14)(q10;q10)，其中嚴重少精子癥組中檢測到45,XY,rob(13;14)(q10;q10)共14例(1.93%)，對照組檢測到3 例(0.30%)，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 性染色體異常核型分布情況（例）

表2 常染色體異常核型分布情況（例）

二、染色體多態性核型分析

在2664 例精子數異常的患者中共檢測到染色體多態性核型131 例(4.92%)，993 例對照組中共檢測到56 例(5.64%)，兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。 染色體多態性核型中檢出率最高的為D/G 組隨體柄變異，共檢測出78 例，占比41.71%；其次為46,XY,inv(9)(p12q13)，共檢測出39 例，占比20.86%；檢測出46,X,Yqh- 共18 例，其中16 例為無精子癥，2 例為嚴重少精子癥。 染色體多態性核型分布情況見表3。

表3 染色體多態性核型分布情況（例）

注：與對照組比較：*P＜0.05

三、Y 染色體微缺失分析

在2664 例精子數異常的患者中共檢測到Y 染色體微缺失177 例(6.64%)，993 例對照組中未檢測到Y染色體微缺失。 在嚴重少精癥組中Y 染色體微缺失檢出率最高，顯著高于無精子癥組和少精子癥組(P＜0.05)，見表4。在所有微缺失類型中檢出率最高的為AZFc，共檢 出118 例， 占 比66.67%， 其 次 為AZFbc， 占 比15.82%。 AZFa、AZFb、AZFbc 和AZFabc 共檢出55 例，其中51 例(92.73%)為無精子癥，4 例為嚴重少精子癥。

表4 Y 染色體微缺失類型分布情況（例）

四、Y 染色體微缺失合并染色體核型分析

在177 例Y 染色體微缺失的患者中共檢測到32例(18.08%)合并染色體核型異?；蚨鄳B性，均涉及性染色體。 主要為染色體多態性核型46,X,Yqh-， 檢出15例，占比為46.88%；其次為性反轉核型檢出7 例，占比為21.88%， 包括6 例46,XX 和1 例46,XX,13pstk+，7例患者均檢測到SRY 基因；另外檢測出5 例涉及Y 染色體長臂部分區帶缺失的患者，占比為15.63%；檢出標記染色體核型5 例， 占比為15.63%， 包括4 例46,X,+mar 和1 例46,X,9qh+,+mar。 11 例AZFabc 缺失患者其核型均異常，28 例AZFbc 缺失患者中有17 例檢出異常核型，118 例AZFc 缺失患者中有4 例檢出異常核型，見表5。

表5 32 例Y 染色體微缺失合并染色體核型異?；蚨鄳B性情況分析（例）

討 論

染色體數目異常、 結構異常和多態性變異是導致男性不育的重要遺傳因素[6]。 本研究中在男性精子數異常人群中染色體核型異常檢出率為9.08%，染色體多態性變異檢出率為4.92%， 與國內相關文獻報道類似[7,8]。精子數異常組中性染色體核型異常檢出率顯著高于對照組，差異有統計學意義；而常染色體核型異常和多態性變異與對照組比較差異無統計學意義， 可見影響男性精子生成的主要因素為性染色體異常。

克氏(Klinefelter)綜合征(47,XXY)，是導致男性不育常見的遺傳因素， 臨床特征主要表現為睪丸發育障礙、不育、體征呈女性化傾向和性腺機能減退；其發生機制主要是配子形成時減數分裂中的性染色體不分離或受精卵卵裂時X 染色體不分離所致[9]。在本研究中檢出47,XXY 共145 例，主要表現為無精癥和嚴重少精子癥，特別是在無精子癥組其檢出率高達8.74%。 在本研究中檢出7 例男性性反轉核型，均為無精子癥；該類患者一般外生殖器正常，成年后因不育而就診，其典型特征為46,XX 核型、正常男性表型、小睪丸、無精子癥和性腺功能減退。 絕大多數患者能檢測到SRY 基因的存在， 其機制為減數分裂時靠近Y 染色體擬常染色體區域的SRY 基因在交叉互換時轉移到了X 染色體上[10]。本研究中檢出4 例涉及X 染色體和常染色體間的平衡易位攜帶者，臨床均表現為無精子癥；X 染色體和常染色體間的平衡易位會導致減數分裂中X 染色體和Y染色體配對失敗， 幾乎所有的X 染色體和常染色體間的平衡易位攜帶者都因減數分裂中性染色體聯會時形成的性泡(Sex Vesicle)破壞使精子發生停滯而不育；而精子發生需要正常的性泡形成， 對其任何干擾都會影響精子的發生過程[11]。

羅伯遜易位是最常見的平衡性染色體重排， 人群發病率約為千分之一[12]，羅伯遜易位的攜帶者通常表型正常，但可產生不平衡的配子。 有文獻報道在男性不育人群中羅伯遜易位攜帶者3.8%表現為無精子癥，84.6%為少精子癥[13]，其攜帶45,XY,rob(13;14)(q10;q10)的頻率大約是新生兒的10 倍[14]。 本文研究結果表明精子數異常組常染色體異常檢出率和對照組比較差異無統計學意義； 但在嚴重少精子癥患者中檢出14 例45,XY,rob(13;14)(q10;q10)，和對照組比較差異有統計學意義；在無精子癥組和少精子癥組各檢測出2 例45,XY,rob(13;14)(q10;q10)。 另外檢測出其他羅伯遜易位核型5例，3 例為嚴重少精子癥，2 例為少精子癥。 有研究認為羅伯遜易位可能導致減數分裂中聯會異常， 不能形成配子，也可能由于減數分裂檢驗點的干預，使細胞不能進入減數分裂第二次分裂而發生凋亡， 從而影響精子的發生導致不育[15]。本研究在常染色體異常中檢出涉及1 號染色體的平衡易位攜帶者5 例和倒位攜帶者4 例，其中2 例為無精子癥，5 例為嚴重少精子癥，2 例為少精子癥。 有文獻報道表明易位或倒位斷點涉及1 號染色體p13、p36、q12、q21、q24、q25 和q32 區域時可能影響精子發生，導致無精癥或少精癥，本研究檢測出的1號染色體上易位和倒位斷點區域與文獻報道類似；其發生機制可能為影響了染色體的配對、聯會；也有研究認為1 號染色體可能帶有影響男性生育的重要染色體結構域，其破壞可導致不育；也可能是易位或倒位在染色體上的斷點破壞了精子發生的關鍵基因[16,17,18]。

本研究中Y 染色體微缺失在精子數異?；颊咧袡z出率為6.64%，和Elfateh F 等[19]報道的中國東北地區Y染色體微缺失檢出率12.95%相比要低， 可能是不同地區遺傳背景、 研究的樣本人群和檢測位點不同等因素導致的。 在嚴重少精子癥組Y 染色體微缺失檢出率最高，達10.91%，和其他組比較差異有統計學意義。 在所有缺失類型中檢出率最高的為AZFc 缺失， 占比為66.67%，與文獻報道類似[19]。Y 染色體特異性部分(male specific region,MSY)中發現有大量的回文序列，回文序列基因對之間有高度的同源性， 每個基因在回文結構中均存在兩份拷貝[20]；有研究認為AZFc 區的缺失是該區域同源序列重組導致的[21]。研究資料表明，AZFa 區域的完全缺失會導致患者生精組織病理類型為唯支持細胞綜合征(sertoli cell only syndrome,SCOS)，AZFb 區域的全缺失會影響精母細胞減數分裂， 使生殖細胞成熟停滯，而AZFc 區的全缺失臨床表現為無精子癥或嚴重少弱精子癥[22]。 本研究中檢測出1 例部分AZFa 缺失(sY84 缺失) 為少精子癥，2 例AZFb 為嚴重少精子癥，其余AZFa 和AZFb 缺失均表現為無精子癥；AZFc 缺失中32.20%為無精子癥，63.56%為嚴重少精子癥，4.24%為少精子癥；而涉及更大片段缺失的AZFbc 和AZFabc缺失均表現為無精子癥。 目前認為AZFa 和AZFb 缺失的無精子癥患者很難通過睪丸取精術(testicular sperm extraction,TESE) 獲得精子， 而AZFc 缺失患者通過TESE 獲得精子的幾率較高[23]；有研究報道AZFc 缺失患者通過顯微睪丸取精術(microscopic TESE,mTESE)成功獲得精子的幾率為70.4%[24]。

本研究中共檢出32 例Y 染色體微缺失合并性染色體核型異?；蚨鄳B性的患者， 其主要為涉及大片段缺失類型的AZFabc 和AZFbc 缺失，11 例AZFabc 缺失患者其核型均異常，28 例AZFbc 缺失患者中有17 例(60.71%)核型異常。 有文獻報道認為AZF 區域的微缺失不僅與精子發生有關，還會影響Y 染色體的穩定性，可能引起Y 染色體易位、缺失或丟失[25]。 Y 染色體長度的變異包括Yqh-(小Y，Y≤21 號染色體)和Yqh+(大Y，Y≥18 號染色體)，其通常被認為是人類染色體多態性的一種，但越來越多研究表明Yqh- 和男性不育有很大關系；其機制可能為Yqh- 的異染色質部分或者完全丟失，引起常染色質排列疏松，造成基因功能喪失和精子生成異常； 或是小Y 染色體染色質排列過度緊密影響其功能的發揮；也可能為Yqh-中有很高幾率的Y 染色體微缺失存在導致生精障礙[26,27]。本研究檢測出的18例Yqh-全部精液異常，且15 例(83.33%)合并有Y 染色體微缺失， 可見Y 染色體微缺失是導致其生精障礙的主要原因。 這提示我們在臨床上遇到男性不育患者出現Yqh-時，應建議其進行Y 染色體微缺失檢測。

本研究在2664 例精子數異常的男性不育患者中檢出染色體核型異?；?和)Y 染色體微缺失異常387例(14.53%)，可見染色體核型異常和Y 染色體微缺失是導致男性生精障礙的主要遺傳原因。 染色體平衡易位或羅伯遜易位攜帶者不僅和男性不育相關， 還可在減數分裂中形成不平衡性配子導致胎兒畸形和流產；而AZFc 缺失的患者大多可通過卵胞漿內單精子顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)獲得后代，但同時也可將遺傳缺陷傳給男性胎兒。 鑒于此，針對由遺傳因素導致不育的男性患者， 在進行輔助生殖時進行胚胎植入前基因檢測 (preimplantation genetic testing,PGT)顯得非常重要。 在本中心就診的患者主要來自于重慶、四川和貴州等西南地區，通過本文的分析研究顯示遺傳因素是導致該地區男性不育的重要原因， 可見對男性不育癥患者進行常規染色體核型分析和Y 染色體微缺失檢查， 對疾病的診斷和治療方案的選擇是非常有必要的。