兩種質量規范在睪酮、皮質醇檢測性能驗證中的應用比較

廖紅娟，張 援，宋愛晶，孫 娟，官凌菊

（廣東省體育科學研究所，廣東 廣州 510663）

血睪酮（T）是機體內活性最高的一種雄激素，主要功能為促進機體的合成代謝。 一般認為，運動員適應訓練負荷或身體機能良好時，睪酮水平變化不大，且有體能增強伴有睪酮增加的趨勢；而在疲勞、過度訓練或機能狀態不佳時，睪酮水平則會明顯下降， 所以血清睪酮可作為運動員選材和評定運動員機能狀態的重要指標。 皮質醇（COR）是由腎上腺皮質分泌的一種甾體類糖皮質激素， 是促進機體進行分解代謝的重要激素， 尤其是對運動過程中涉及糖代謝的過程有重要的調節作用：在運動過程中升高可促進糖原分解供能，提高運動能力；在運動后持續保持高水平則會造成機體分解代謝過強， 不利于身體恢復， 因此皮質醇常用于評定運動員腎上腺皮質的機能和機體恢復狀況［1］。

運動后睪酮和皮質醇的變化都較為復雜， 并且存在很大的個體差異（生物學變異），再加上測試過程中實驗室所用的檢測方法、人員操作等因素也會對檢測結果產生較大影響，從而影響睪酮和皮質醇在監控運動員訓練效果和身體機能狀態中的精準應用。 在上述諸多影響因素中，檢測方法的分析性能對檢測結果正確性起關鍵作用， 實驗室須選擇分析性能優良的檢測方法才能保證檢測結果的準確性和可靠性。 那么怎樣對檢測方法的分析性能進行客觀的評價呢？ 目前臨床實驗室一般是選擇美國臨床實驗室改進修正法案’88 （CLIA’88）能力驗證分析質量要求作為檢測方法分析性能驗證時的評價標準［2-5］。 而由生物學變異推導出的質量規范是建立在大量實驗研究和臨床工作經驗的基礎之上［6］，該質量規范雖被越來越多的實驗室所接受， 并廣泛應用于室內質量控制和室間質量評價中，但其在檢測方法分析性能驗證中的應用報道較少見。綜上所述，本研究的目的是分析上述兩種質量規范在睪酮、皮質醇主要分析性能驗證中的應用， 以期找到適合運動生化實驗室檢測質量管理要求的質量規范，確保檢測結果的準確性，從而做到精準地服務于體育科研。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器為西門子公司ADVIA Centaur XP 化學發光免疫分析儀。 試劑為西門子公司提供的T 試劑盒（批號180037）及校準品（批號 C7137）、COR 試劑盒（批號 019331）及校準品（批號 CE59）。

1.2 試驗樣本

精密度驗證試驗選用伯樂公司生產的免疫測定質控品，2個不同濃度水平（低值40 381，高值40 383），為減少瓶間差異，取2 套質控品按廠家說明書進行復溶，充分混勻后分裝保存于-20℃。 正確度驗證試驗選用國家衛生健康委臨檢中心2021 年 第 1 次 內 分 泌 室 間 質 評 的 5 個 樣 本 （202111 ～202115）。

1.3 方法

1.3.1 儀器準備

檢測人員能熟練操作儀器， 根據廠家說明書規定的方法進行項目校準，校準后進行室內質量控制，質控結果在控才能進行試驗樣本的檢測。

1.3.2 精密度驗證

依據 WS/T 492-2016［7］、CLSI EP15-A3［8］文件要求，對兩個濃度水平的質控品連續測定5 天，每天一個分析批，每個濃度水平分別取 3 支分裝樣本檢測， 如此， 每個濃度水平得到15 個數據，計算每個濃度水平的批內變異系數（CV批內）和總變異系數（CV總）。 進行計算之前，先依據 WS/T 420-2013《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》［9］建議進行離群值判斷：計算所有測定值的總均值和標準差（SD），單次測定值如超出，則判斷為離群值。離群值數量不超過總測試數據量的5%，故本實驗至多允許剔除一個測試數值，如超過一個，該項目需重新檢測。

1.3.3 正確度驗證

依據 WS/T 492-2016［7］、CLSI EP15-A3［8］文件要求，對國家衛健委臨檢中心2021 年第1 次內分泌室間質評的5 個不同濃度水平樣本連續測定5 天，每天每個樣本重復測定兩次，每個樣本可得10 個數據，計算每個樣本的均值、標準差、95%置信區間、與同組靶值比較的百分偏差。

1.3.4 質量規范

CLIA’88 質量規范規定睪酮、皮質醇的允許總誤差（TEa）均為 25%［6］。 生物學變異包括個體內（CVI）和個體間（CVG）生物學變異，由生物學變異推導出的質量規范有“最低”“適當”“最佳”3 個層次， 最低的質量規范：CVA（分析不精密度）＜0.75CVI，BA（分析偏倚）＜0.375（CVI2+ CVG2）1/2；適當的質量規范：CVA＜0.50CVI，BA＜0.250 （CVI2+ CVG2）1/2； 最佳的質量規范：CVA＜0.25CVI，BA＜0.125（CVI2+ CVG2）1/2［6］。 睪酮、皮質醇的 CVI和CVG來源于Ricos 等［10］建立的生物學變異數據庫，由這些數據計算出的質量規范的具體數據見表1。本研究中精密度驗證試驗以 1/4CLIA’88TEa （批內不精密度）、1/3CLIA’88TEa（實驗室總不精密度）、 生物學變異導出的允許CV 作為評價標準，正確度驗證試驗以1/2CLIA’88TEa、生物學變異導出的允許Bias 作為評價標準。

表1 由生物學變異數據導出的質量規范

1.4 統計學分析

按照 WS/T492-2016、EP15-A3 文 件 要 求 ， 使 用 Excel2010、SPSS23.0 進行精密度、正確度驗證的相關計算。

2 結果

2.1 離群值檢驗

通過將每個濃度水平15 個檢測結果的最小值、最大值與各自水平的上下限比較，未發現離群值，見表2。

表2 T、COR 精密度驗證離群值結果

2.2 精密度驗證結果

睪酮、皮質醇的不精密度均滿足CLIA’88 質量標準。以基于生物學變異的質量規范作為評價標準時， 睪酮的不精密度小于生物學變異導出的適當允許不精密度； 皮質醇的不精密度小于生物學變異導出的最佳允許不精密度，見表3。睪酮、皮質醇的兩水平驗證樣本通過精密度驗證。

表3 T、COR 精密度驗證結果

2.3 正確度驗證結果

從表4 可以看出，睪酮、皮質醇的5 個不同濃度樣本的測定均值與靶值的百分偏差均小于1/2CLIA’88 TEa 要求。 睪酮低濃度樣本的百分偏差最大，為-9.43%，大于生物學變異導出的適當允許偏倚，且其靶值也超出95%置信區間上限，未通過驗證；其它濃度樣本的正確度良好，通過驗證。 皮質醇的不同濃度樣本的百分偏差均小于生物學變異導出的最佳允許偏倚，同時靶值均包含在95%置信區間內，正確度良好，驗證通過。

表4 T、COR 正確度驗證結果

3 討論

精密度和正確度是臨床檢驗定量測定項目分析性能特征的主要指標。 未做修改的經確認的檢測程序在常規使用之前，實驗室應對其主要分析性能進行驗證； 或檢測程序在投入使用后，由于儀器設備的老化和磨損等原因都會影響檢測結果，所以實驗室也應定期至少對檢測項目的精密度和正確度進行驗證， 以確保其性能參數持續符合實驗室的質量目標和使用要求［11］。

一個實驗室選擇什么樣的質量規范作為檢測程序性能驗證的評價標準， 在一定程度上可表明實驗室檢測水平能達到何種程度。 CLIA’88 質量規范是基于法規和室間質評而制定的法規文件，在質量規范層級模式中處于第四級。 臨床實驗室通常把CLIA’88 可接受限作為允許總誤差（TEa），然后根據經驗將允許總誤差轉換為允許偏倚（一般為≤1/2TEa）和允許不精密度 （一般為批內不精密度≤1/4TEa， 總不精密度≤1/3TEa），作為實驗室正確度和不精密度的評價標準［12-13］。 該質量規范不僅缺乏客觀合理的依據， 而且在當前技術水平條件下其評價限過于寬松，不利于實驗室檢測質量的提高。 基于生物學變異的質量規范是通過調控項目的分析變異與生物學變異的比值所得， 綜合考慮了健康人群生物學變異和臨床工作需求，是較為客觀合理的質量規范，處于質量規范層級模式的第二級，其性能優于 CLIA’88 質量規范［6，14］。 該質量規范根據健康人群檢測項目的個體內、個體間生物學變異數據，通過一定的研究模型導出不精密度（CV%）、偏倚（Bias%）和總誤差（TEa%）3 個分析質量指標的質量規范。 如果一個檢驗項目的檢測質量能達到基于生物學變異的質量要求， 則可認為分析變異在檢測過程中造成的結果改變是可以被接受的。

精密度是指在規定條件下， 對同一或類似被測量對象重復測量所得示值或測得值間的一致程度， 反映測量結果隨機誤差的大小［7］，常用不精密度表示。 較低的不精密度不僅可減少個體試驗結果的固有變異性， 而且還有利于減少室內質量控制的成本。那么不精密度要低到什么程度才算是好的呢？相關學者通過計算得出分析不精密度小于1/2 個體內生物學變異（CVA＜0.50CVI）是合理的且是應用最為廣泛的精密度質量規范（適當的精密度質量規范），此時約有12%的分析變異增加到試驗結果的變異性中。 不同檢驗項目生物學變異是不同的，目前它們能達到的分析質量水平也不盡相同的，當檢驗項目很容易達到適當的精密度質量規范時， 則選擇更為嚴格的精密度質量規范（最佳的精密度質量規范）作為評價標準，分析不精密度小于 1/4 個體內生物學變異（CVA＜0.25CVI），這時僅有3%的分析變異增加到試驗結果的變異性中；反之，則選擇不太嚴格的精密度質量規范（最低的精密度質量規范）作為評價標準， 分析不精密度小于3/4 個體內生物學變異 （CVA＜0.75CVI），此時則至多有25%的分析變異增加到試驗結果的變異性中［6］。本研究中精密度驗證結果顯示，睪酮、皮質醇兩水平驗證樣本的不精密度雖然能輕松滿足CLIA’88 的CV 值要求，但無法對睪酮、皮質醇檢測過程中的分析變異進行定量。當選擇生物學變異推導出的精密度質量規范作為評價標準時，皮質醇的不精密度能滿足最佳的允許CV 要求，說明隨機誤差較小，在皮質醇檢測過程中至多有3%的分析變異可能會被帶入到檢測結果的變異中； 睪酮的不精密度能滿足適當的允許CV 要求， 說明睪酮檢測過程中約有12%的分析變異可能會被帶入到檢測結果的變異中。

測量正確度是指無窮多次重復測量所得量值的平均值與一個參考值間的一致程度， 反映測量結果系統誤差的大小［7］，常用偏倚表示。 基于生物學變異的偏倚質量規范也有適當、最佳、最低3 個層次，反映了實驗室檢測結果的正確性，以及與其他實驗室之間的可比性。 本研究中正確度驗證試驗使用了5 個不同濃度樣本，基本覆蓋了整個測量區間，能有效減少隨機誤差對驗證結果的影響。 正確度驗證結果顯示，當選擇1/2CLIA’88 TEa 作為評價標準時，睪酮、皮質醇的正確度驗證可輕松通過。 當選擇生物學變異推導出的偏倚質量規范作為評價標準時， 皮質醇的偏差均能滿足最佳的允許Bias 要求，通過驗證，說明皮質醇檢測結果準確可靠；睪酮的偏差整體上能滿足適當的允許Bias 要求，但低值樣本的偏差較大，且其靶值超出了95%置信區間上限，未通過驗證，說明睪酮低濃度樣本檢測結果受系統誤差的影響比較大， 所以日常工作中對睪酮低濃度樣本的檢測結果應給予足夠重視， 必要時制定相關的規則進行復檢。

由生物學變異導出的質量規范與檢測項目個體內及個體間的穩態調定點密切相關，所得允許不精密度、允許偏倚、允許總誤差更加合理和嚴格， 將它作為檢驗項目分析性能驗證的評價標準更科學合理。 目前，國內外尚缺乏關于專業運動員人群生化指標的生物學變異數據， 故本研究中睪酮和皮質醇生物學變異數據來源于國外學者提供的全球健康人群的研究數據［10］。 在將來的工作中，實驗室可以對運動員人群血液生化指標的生物學變異進行研究， 再將其應用于運動生化實驗室的檢測質量控制中， 更好地保證運動員血液生化指標檢測結果的準確性。

4 結論

在當前技術水平條件下，本實驗室開展的睪酮、皮質醇項目的精密度和正確度能輕松滿足CLIA’88 質量規范， 但該質量規范的評價限過于寬松，不利于實驗室檢測質量的提高。 經統計學分析，推薦選擇基于生物學變異的“適當的質量規范”和“最佳的質量規范”作為本實驗室乃至其他運動生化實驗室中睪酮、皮質醇分析性能驗證的評價標準，既能保證實驗室高水平的檢測質量， 又有利于科研人員科學地評價檢測結果的變異是否真實反映運動員身體機能水平的改變， 從而為運動隊提供更精準的科技服務。