番茄雙鏈RNA綁定蛋白(SlDRB)基因家族鑒定及抗TYLCV防御反應分析

黃 鑫 方遠鵬 岳寧波 張 龍 吳 丹 李云洲

(貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025)

番茄(Solanumlycopersicom)為茄科番茄屬園藝作物，含有豐富的番茄紅素、維生素C、類胡蘿卜素等營養(yǎng)元素[1]。目前，番茄病蟲害嚴重限制了番茄的高產和優(yōu)質生產，其中病毒病害影響嚴重且不易防控，威脅著番茄的大面積推廣和種植[2]。為解決病毒侵染帶來的生產限制，目前可采用的方法包括增強植物植株先天抗性[3]、抗病毒藥劑[4]的開發(fā)以及病毒侵染介質的防控[5]，其中最為有效和經濟的抗病毒策略是增強植物植株先天抗性，即抗病毒育種。植物體的先天抗病毒策略主要有兩種，即R基因介導的抗病毒途經與RNA干擾信號途經[6]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是植物抗病毒的重要機制，參與RNAi機制的蛋白包括核酸內切酶DCL(Dicer-like)、RNA依賴的RNA聚合酶RDR(RNA-dependent RNA Polymerase)和AGO蛋白(Argonaute)，DCL主要通過剪切雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)形成初級小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，RDR可以將siRNA重新反轉錄成為新的dsRNA，新合成dsRNA再次經過DCL剪切形成次級siRNA，AGO蛋白與siRNA結合形成RNA誘導的沉默復合體(RNA induced silencing complex，RISC)，通過堿基互補配對方式降解外源RNA或病毒[7]。在此過程中，產生的大量次要蛋白也可以有效促進反應的完成及信號增強。雙鏈RNA結合蛋白(dsRNA-binding proteins, DRB或dsRBPs)是一種參與RNAi通路的重要蛋白[8]，在動物[9]、微生物[10]、植物[11]中廣泛存在，該蛋白能參與抗病毒粒子的形成、RNA的加工形成、病毒信號識別等過程[12]。

DRBs作為輔助因子，可同DCLs在促進小干擾RNA的產生直到RISC的組裝中，始終促進RNAi的發(fā)生[13]。DRBs最初被認為具備兩個雙鏈RNA結構域(DRB4D1和DRB4D2，又稱DSRM)，典型的DRB蛋白包含約70個氨基酸組成的α1-β1-β2-β3-α2結構[14]。但是不同分支下的DRB蛋白存在明顯差異，如結構域的分布位置以及數量等[15]。目前DRB蛋白在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)等植物基因組的成員數大多為10個以內，并且對DCL的活性至關重要[15]。前人研究表明擬南芥中DRB4介導了番茄斑點枯萎病病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)過程中21 nt病毒siRNA的合成[13]；另外蕪菁花葉病毒(turnip yellow mosaic virus, TYMV)感染寄主后，會誘導寄主DRB4表達，從而抑制病毒外殼蛋白的積累[16]。DRB4蛋白參與蕪菁皺紋病毒(turnip crinkle virus, TCV)的識別過程，使R基因介導的特異性免疫能正常識別病毒外殼蛋白(coat protein, CP)，DRB4促進植株對TCV病毒的超敏反應從而形成穩(wěn)定的復合物[17]。煙草DRB2參與馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)侵染過程并引起病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)植物防御反應，從而產生免疫反應(PAMPs triggered immunity，PTI)誘導組織壞死[18]。

DRB基因家族參與RNAi過程，促進植物病毒的降解，在RNAi抗病毒過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用生物信息學的方法，鑒定出番茄SlDRB基因家族，并對其性質和抗病毒防御反應進行分析，旨在為番茄DRB抗病毒研究奠定基礎，同時為研究SlDRB基因家族在番茄RNAi抗病毒研究中的功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為矮番茄[19]，源自西北農林科技大學園藝學院番茄種質創(chuàng)新實驗室，TYLCV侵染性克隆來自中國農業(yè)大學植物保護學院周濤實驗室。

1.2 序列獲取和DRB基因家族的鑒定

擬南芥、番茄序列來自TAIR(https://www.arabidopsis.org/)及Sol Genomics Network(https://solgenomics.net/)數據庫。采用擬南芥DRB基因(AtDRB)家族全部蛋白序列對番茄蛋白組進行鑒定，將合并去重獲得的全部基因置于NCBI-CD數據庫確認結構域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)，保留其具備DSRM結構域的蛋白基因。基于番茄基因組注釋文件獲得SlDRB基因的基本信息。最后利用在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和PSORT(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html)進行基礎理化性質和亞細胞定位分析[20]。

1.3 番茄DRB蛋白質系統(tǒng)發(fā)生分析

根據DNAMAN軟件對擬南芥與番茄的多序列比對結束，進行番茄DRB基因的命名。然后根據擬南芥、番茄DRB家族蛋白序列通過Clustal X2.1軟件進行多重比對分析，基于比對結果，利用MEGA7.0軟件采用相鄰連接法(neighbor-joining，NJ)構建進化樹，設置bootstrap為1000[21]。

1.4 保守基序的鑒定及結構分析

利用 MEME (http://meme.Nbcr.net/meme/intro.html)[22]在線平臺進行番茄 DRB蛋白中保守基序(motif)分析，最大motif檢索數值為15，E-value < 0.05。采用SOPMA2.0和Phyer2.0網站進行蛋白高級結構的預測，并用pyMOL軟件[23]進行蛋白質三級結構的繪制(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.plpage=npsa-sopma.html、http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)。

1.5 基因結構和染色體定位、組織表達分析

根據染色體注釋信息中包含的DRB基因的結構注釋，利用TBtools v1.068對DRB基因的基因結構和染色體定位進行繪制。并通過BAR ePlant(http://bar.utoronto.ca/eplant_tomato/)檢查番茄DRB(SlDRB)基因在不同組織的表達特征[24-26]。

1.6 DRB基因表達分析

精選矮番茄種子，溫湯浸種后，放置于人工氣候箱進行催芽，3 d后種子露白播種于滅菌基質，置于人工氣候室進行培養(yǎng)。選取生長一致的5片真葉的幼苗進行接種番茄黃葉曲葉病毒(TYLCV)侵染性克隆，對照接種空載體，接種方法參考文獻[27]。取樣時間分別為接種后0、7、14 d。采用 Trizol法提取總RNA，經DNaseI處理去除基因組DNA，2 μg RNA經TaKaRa公司(大連)Primescript RT Reagent Kit試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈，稀釋后做模板。根據番茄數據庫基因序列，利用Primer 3.0設計引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。熒光實時定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)反應試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司SYBR Master mix(TaKaRa，大連)，反應體系為20.0 μL：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TliRNaseH Plus)(2×)10.0 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，無菌雙蒸餾水6.4 μL。反應條件為:95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)；融解曲線分析95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s，在CFX96TM Real - time System熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行。采用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量，每個基因的表達反應重復3次，以Actin作為內參基因。

表1 研究所用的PCR引物Table 1 The sequence of PCR primers in this study

2 結果與分析

2.1 番茄DRB基因家族鑒定及基本理化性質分析

基于擬南芥序列Blastp結果和結構域特征獲取番茄基因組的SlDRB基因，共得到8個含有DRB結構域的番茄SlDRB蛋白編碼基因，根據它們同擬南芥序列的多序列比對同源性的相似度進行命名，相似度過低的以基因所處位置從SlDRB6開始依次往后命名(表2)。所有SlDRB蛋白編碼基因的長度不固定，范圍從SlDRB7的378 bp到SlDRB3的1 662 bp。所編碼蛋白的長度為125～553 aa，分子量為14.2～60.2 kDa。另外，8個基因等電點均處于5.28～9.57之間，堿性蛋白包括SlDRB2、SlDRB3、SlDRB5，酸性蛋白包括SlDRB1、SlDRB4、SlDRB6、SlDRB8，近中性蛋白(6.5

表2 DRB基因家族基本理化性質Table 2 The Basic physical and chemical properties of DRB protein family

2.2 擬南芥、番茄DRB基因的結構、染色體定位分析

基于注釋文件中對SlDRB基因的定位信息，通過TBtools繪制SlDRB基因的染色體定位及基因結構圖，進而綜合分析番茄SlDRB基因的改變情況。染色體定位顯示8個SlDRB基因分布在番茄6條染色體上。其中，1號染色體上含有的SlDRB基因最多，包含SlDRB4、SlDRB6、SlDRB7，2、3、4、5、11號染色體各分布1個SlDRB基因。另外，SlDRB1、SlDRB2、SlDRB3、SlDRB5、SlDRB8染色體分布位置具有共同的特征，即均處于染色體下端，SlDRB6處于染色體上端，不同的是SlDRB4和SlDRB7成簇分布于1號染色體的中部(表2、圖1-C)。

根據AtDRB和SlDRB氨基酸序列建立的進化樹，可將DRB分為3個分支，即AtDRB2/3/5和SlDRB2/3、SlDRB6/7、AtDRB1/4和SlDRB1/4/5/8三支。其中AtDRB2/3/5和SlDRB2/3分支、AtDRB1/4和SlDRB1/4/5/8分支均包含2～3個內含子，SlDRB6/7分支包含0～1個內含子。SlDRB6是唯一缺乏3′端UTR的DRB基因，SlDRB4、SlDRB5則缺乏5′端UTR(圖1-A、B)。

圖1 擬南芥、番茄DRB蛋白的進化樹及編碼基因的基因結構(A)、染色體定位關系(B)Fig.1 Phylogenetic tree of DRB protein in Arabidopsis and tomato and gene structure (A), chromosomal localization relationship (B) of coding gene

2.3 番茄DRB蛋白特性分析

基于NCBI-CD網站預測結果，顯示SlDRB蛋白可以分成4類，第一類包括5個成員：SlDRB1、SlDRB2、SlDRB3、SlDRB4、SlDRB5，C端具2個DSRM結構域的DRB蛋白基本特征；第二類僅有SlDRB6，包含3個DSRM結構域，1個DSRM結構域保留在C端，2個DSRM結構域處于近中央的位置；第三類僅有1個成員SlDRB7，在C端出現(xiàn)一個DSRM結構域；第四類只有SlDRB8，在N端出現(xiàn)一個DSRM結構域。但是第三類SlDRB7和第四類SlDRB8蛋白結構不完整，暗示SlDRB7、SlDRB8的功能與其他有差異。

利用MEME網站預測番茄DRB蛋白、番茄及擬南芥DRB蛋白全部保守基序。結果顯示，番茄DRB蛋白發(fā)現(xiàn)4個高度保守基序，其中motif A1和motif A2、motif A3和motif A4分別代表DSRM結構域的保守結構(圖2-A)。在2種物種的保守基序中共發(fā)現(xiàn)9個高度保守基序，除了幾個與motif A1～A4相對應的motif B1～B5外，SlDRB2和SlDRB3蛋白還存在4個新的保守基序，即motif B6～B9(圖2-A、B)。

圖2 番茄DRB蛋白的保守基序(A)、番茄及擬南芥DRB蛋白的保守基序(B)、保守基序圖標(C)分析Fig.2 Analysis of conserved motif of DRB protein in tomato (A), motif of DRB protein in tomato and arabidopsis (B), motif graph (C)

另外，在SlDRB和AtDRB蛋白序列中第1和第2個DSRM結構域維持了兩段保守的基序，分別為‘K*LQ*Y*G*H*F*V’和‘A*A’基序、‘K*L*E*P*Y’和‘G*K*A*A’基序。在番茄內還存在P、G、A等氨基酸，這些氨基酸在8個DRB蛋白的DSRM結構域區(qū)域內保持穩(wěn)定(圖2-C)。其次在PSORT的預測中，8條SlDRB蛋白被定位為胞外、細胞質、細胞核3個場所，其中胞外的最多，共5個，分別為SlDRB1、SlDRB5、SlDRB6、SlDRB7、SlDRB8，其次SlDRB2、SlDRB3被定位于細胞質，SlDRB4蛋白被定位于細胞核(表3)。

表3 DRB家族蛋白二級結構及亞細胞定位分析Table 3 Analysis of the secondary structure and subcellular localization of DRB family proteins

2.4 番茄DRB蛋白結構分析

利用SOPMA 2.0網站對SlDRB蛋白質的二級結構進行預測，結果表明大部分SlDRB蛋白質二級結構以無規(guī)則卷曲為主，如SlDRB2、SlDRB3、SlDRB4、SlDRB6、SlDRB7、SlDRB8，其次是α-螺旋和延伸鏈，三者占比分別為46.45%～65.46%、20.80%～36.11%、8.45%～22.4%。SlDRB1蛋白主要以延伸鏈為主，其次是α-螺旋和無規(guī)則卷曲；SlDRB5的無規(guī)則卷曲與α-螺旋區(qū)域均為43.92%，延伸鏈占14.14%(表3)。

通過Phyer 2.0構建8條SlDRB蛋白的三級結構，結果顯示不同的SlDRB蛋白三級結構差距較大。大部分SlDRB蛋白具備豐富的α-螺旋區(qū)域和延伸鏈，構型差距大，成圈狀、椅狀、鉗狀等多種構型。但是SlDRB1、SlDRB5的結構與二級結構預測結果存在差距，以無規(guī)則卷曲為主(圖3、表3)。

注：紅色、黃色、綠色分別代表α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲。Note: The red, yellow, green represent α-helix, sheet, loop, respectively.圖3 番茄DRB蛋白三級結構分析Fig.3 Tertiary structure analysis of tomato DRB protein

2.5 番茄DRB基因組織表達分析

基于ePlant提供的番茄組織表達分析，得到8個SlDRB基因在10種不同階段或組織中的基因表達譜。綜合分析組織表達的卡通熱圖和普通熱圖，獲得SlDRB家族的組織特異性表達圖譜(圖4)。分析顯示，SlDRB5和SlDRB6在植株中整體表達較低，而其余6個SlDRB基因(SlDRB1～4、SlDRB7～8)在所有組織的各個階段均有較高水平表達。SlDRB5在開放的花和葉片中表達水平最高，其次是果(3 cm直徑)和花蕾，在根和幼果不表達；SlDRB6僅在花蕾中表達，在開放的花和果實中表達非常低。此外，8個SlDRB基因均在葉片組織中表達，大多數基因都在根、花、果組織中達到最高的表達水平。

圖4 番茄DRB基因的組織表達分析Fig.4 Expression analysis of the DRB gene family in different tissues

2.6 番茄DRB基因抗TYLCV侵染的表達分析

通過組織表達的分析，初步了解到了番茄DRB基因的特異性。為進一步了解不同階段的基因功能，篩選參與抗TYLCV防御反應的SlDRB蛋白，通過實時熒光定量檢測TYLCV侵染番茄植株不同階段SlDRB的表達情況。由圖5可知，8個SlDRB基因在未處理時相對表達水平較低，TYLCV侵染后不同的SlDRB表達均有升高。其中，SlDRB7、SlDRB8在7 d和14 d時間表達持續(xù)升高，相對表達水平始終高于0 d。SlDRB2、SlDRB3在病毒侵染第7天時表達顯著上調，病毒侵染第14天時表達下調，但表達水平與0 d相比仍然顯著上調。SlDRB1、SlDRB4在初次顯現(xiàn)癥狀時(7 d)表達量變化不顯著，但是在14 d時表達水平顯著上調。SlDRB5、SlDRB6在組織表達分析中整體的表達量偏低，在病毒侵染的7 d時表達水平顯著升高，但14 d時表達水平恢復至初始水平。

圖5 DRB基因家族接種TYLCV后不同時間段的表達分析Fig.5 Expression analysis of different time periods after the DRB gene family was vaccinated against TYLCV

3 討論

病毒病是威脅蔬菜以及其他農作物安全生產的重要病害之一，由于病毒易突變以及傳播介體昆蟲難控制等因素，導致病毒病成為農業(yè)生產中最難防控的一類病害[28]。RNAi是植物抗病毒的重要機制，是植物抗病毒研究以及抗病育種的重要方向[29]，同時也廣泛應用于其他生物逆境，如真菌、昆蟲等病蟲害[30]，并且可拓展延伸至基因編輯效率的研究[31]。而DRB蛋白作為RNAi路徑中的又一重要元件，不僅可以參與病毒粒子的識別和結合，而且可以促進小RNA(sRNA)和RISC的形成[17,32-34]。另外，不同DRB蛋白存在功能分化和拮抗效應[35]。

本研究基于番茄基因組鑒定出8個編碼DRB蛋白的基因家族成員，這些番茄DRB家族(SlDRBs)含有DSRM結構域，其數量和位置在染色體上并不固定。SlDRBs主要分布于染色體的兩端，包括SlDRB1、SlDRB2、SlDRB3、SlDRB5、SlDRB8、SlDRB6，僅SlDRB4和SlDRB7成簇存在于1號染色體的中部。以前的研究中，DRB主要含兩大類，即DRB1、DRB2-3-5(DRB2，DRB3-5)；DRB4(DRB4A、DRB4B)、DRB6，且DRBs往往具備不定量和不同位置的DSRM結構域[14-15]。在擬南芥和番茄的DRB蛋白進化樹中，主要分出3個支，即DRB2/3和AtDRB5分支、SlDRB6/7分支、DRB1/4和SlDRB5/8分支，不同的支內含子數量和蛋白結構分布有所差異。蛋白的亞細胞定位包括胞外、細胞質、細胞核，這些結果表明擬南芥與番茄SlDRB基因的相似度較低，雖然部分番茄DRB蛋白與擬南芥DRB蛋白歸為一支，但大多難以明確分出單個類蛋白。因此，DRB蛋白的功能有待進一步研究分析。

多數基因家族研究中，不同的基因會產生組織特異性表達差異，且同類基因在不同的物種以及基因簇均會產生巨大的差異[36-38]。例如RNAi機制的主要蛋白AGO、DCL、RDR在不同組織器官中同樣表現(xiàn)出組織特異性[39-40]，本研究發(fā)現(xiàn)番茄RNAi機制又一重要蛋白DRB家族同樣存在組織特異性表達。本試驗結果顯示6個SlDRB基因(SlDRB1～4、SlDRB7～8)為組成型表達，并均產生獨特的組織表達差異。另外2個SlDRB基因(SlDRB5和SlDRB6)組織選擇性極強，SlDRB5在根和幼果中表達非常低，SlDRB6在開放的花和果實中表達非常低，但所有的SlDRBs基因在葉組織的表達適中，在根、花、果組織中表達較高，由此可以推測SlDRB可能在根、花、果發(fā)育過程發(fā)揮作用。

DRB基因對于植物抗病毒過程十分重要，前人研究表明DRB2及DRB4蛋白可參與RNA病毒抗病毒防御[13,16-18]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)番茄DRB可參與抗DNA病毒TYLCV的防御反應。在擬南芥研究中同樣存在著獨特的表達特征，Qu等[41]在擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)DRB4對于有效的抗病毒沉默是必需的。雖然番茄幼苗DRB基因均受TYLCV侵染后產生表達水平上調，但顯癥初期(7 d)和顯癥后期(14 d)產生了3類變化趨勢，包括始終表達上調的SlDRB7、SlDRB8，先表達上調后下調的SlDRB2、SlDRB3，僅在7 d或14 d表達上調的SlDRB1、SlDRB4和SlDRB5、SlDRB6。這一現(xiàn)象指示了DRB基因對不同病程階段的差異性表達，然而其分子機制、選擇性上調的原因均有待進一步探索。

4 結論

本研究通過生物信息學分析鑒定到番茄DRB基因家族中共有8個家族成員，分布于6條染色體上。根據氨基酸同源性DRB基因家族可分出3個分支，內含子數量和蛋白結構分布有所差異。亞細胞定位預測細胞質DRB蛋白有SlDRB2和SlDRB3，細胞核DRB蛋白有SlDRB4，其余均為胞外蛋白。不同DRB基因的組織表達均有不同，番茄DRB基因在葉組織的表達都相對適中，大多數基因都在根、花、果組織中取得最高的表達水平。8個DRB基因均參與TYLCV誘導的防御反應，其中SlDRB7、SlDRB8表達水平隨著TYLCV侵染時間持續(xù)上調，可知番茄DRB基因家族不同抗病毒階段的功能不同。