快速現場評估技術在診斷性介入呼吸病學中的應用研究進展▲

譚小玉 黎雨 李文濤 陳俊健 方妮

廣西醫科大學第二附屬醫院，南寧市 530007

【提要】 快速現場評估(ROSE)技術是一項主要以細胞學、病理學和微生物學為基礎，在操作現場迅速對標本開展制片和染色，以及評價和判斷的診斷技術。在呼吸介入診療和呼吸疾病診斷中，免疫熒光標記染色ROSE技術的靈敏度和特異度較傳統ROSE技術高，本文就介入呼吸病學ROSE技術的研究進展進行綜述。

快速現場評估(rapid on-site examination, ROSE)是用穿刺、活檢、刷片等辦法收集標本，并對標本進行快速制片和染色，隨后現場利用顯微鏡對標本進行快速評價、分流和初步診斷，以指引下一步檢查操作的一項診斷技術[1]。1990年Davenport報告在氣管鏡活檢過程中應用ROSE技術可以提高肺惡性腫瘤活檢組織的合格率，從而提高疾病的診斷率[2]。運用ROSE技術除可提升活檢標本的合格率外，還可減少活檢次數和操作時間，且能提供早期診斷根據。最近10年，由于肺結節和肺癌、呼吸疑難病與危重癥感染等早期診治的迫切需要，以及介入呼吸病學技術廣泛應用和不斷更新發展，ROSE技術在呼吸介入診療中得到蓬勃發展，在肺、甲狀腺、腮腺、胰腺和縱隔淋巴結等組織診斷中發揮了重要作用[3-16]。現對診斷性介入呼吸病學的ROSE技術研究進展進行綜述。

1 ROSE的分類及其臨床價值

ROSE為伴隨介入技術發展起來的診斷技術，分為現場細胞學評估(cytological ROSE，C-ROSE )與現場微生物學評估(microbiological ROSE，M-ROSE)兩部分，C-ROSE主要用于判斷細胞良、惡性，M-ROSE主要用于微生物評價，兩者密不可分[14]。C-ROSE的主要臨床價值包括：(1)實時指導經氣管鏡支氣管肺泡灌洗、經支氣管鏡肺活檢、刷檢、黏膜活檢、經支氣管鏡細針吸引活檢、經皮肺活檢、胸膜活檢、經胸腔鏡胸膜活檢，以及其他部位(如皮下或深在部位)針吸脫落細胞學等檢查的開展。(2)在進行各類經氣管鏡介入治療(高頻電刀、氬等離子電凝、冷凍切除、光動力治療、微波治療、激光治療等)過程中，指引介入呼吸病學治療的進程和判斷介入呼吸病學治療效果。(3)經呼吸內鏡確定肺部腫瘤外科手術切除范圍。M-ROSE的主要臨床價值包含：(1)根據形態學特征，初步辨別部分微生物病原，如念珠菌屬、曲霉菌屬、耶氏肺孢子菌、隱球菌和其他類型真菌、病毒包涵體、球菌和桿菌。(2)可現場實時反復取材，保證檢材性標本量。(3)根據細胞分類與計數及其比例等細胞學背景，粗略區分感染性疾病和非感染性疾病，從而制定初步治療的策略，并能夠預估病情嚴重程度和預判療效。

2 傳統ROSE技術

ROSE可安排在手術室、呼吸內鏡室、重癥監護室等場所進行，不受場地限制。所需要的設備和材料比較簡單，包括玻片、染液和顯微鏡。關鍵步驟是應用普通光學顯微鏡或熒光顯微鏡立刻對標本進行觀察和判讀，因此光學顯微鏡或熒光顯微鏡的配置是關鍵，還可配置高清的圖文采集系統和打印設備，以利于出具報告。

ROSE操作分三步驟依序進行，首先是制片，接著是染色，最后是判讀。常用的制片辦法有活檢組織塊滾片(印片) 法、細胞刷涂抹(刷片)法、噴片法與噴射推片法、液基薄層細胞制片法、微孔濾膜過濾法等。制片時需注意厚度適中，涂片均勻。制片結束后，依據實際情況選擇合適的染色方法，立刻開展快速染色。快速染色措施有很多種，現常用的快速染色方案有以下3種：(1)迪夫快速染色[17]，適用于穿刺組織、血液、體液等標本的染色。(2)極快速改良瑞氏染色，可通用于絕大多數C-ROSE與M-ROSE的染色[13]。(3)改良快速巴氏染色，一種比較常用的快速染色方法，雖然其靈敏度和特異度都較極快速改良瑞氏染色高[18]，但染色時間較久，大概為3 min，而且操作需15個步驟，相對繁雜；在C-ROSE過程中往往需要專業技師的幫助，一定程度上限制其使用[19]。其他的快速染色法[13]：極快速改良乳酸染色(改良乳酸酚棉蘭染色)，主要用于判斷真菌感染；快速支原體DNA霍氏熒光染色，主要應用于判斷支原體感染；快速金-羅耐酸菌熒光染色(也叫金胺O-羅丹明熒光染色)，染色呈強陽性為結核分枝桿菌和努卡菌，染色呈弱陽性為軍團菌；試劑盒化快速革蘭染色，主要應用于判斷球菌和桿菌。

染色完成后，清洗玻片，用吸水紙吸干存留玻片上的染液或水分，玻片放置于顯微鏡，現場在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察，在最短時間內對鏡下所看到的細胞形態、排列特點和周圍細胞背景等進行初步認定，并迅速判讀獲得結果，從而根據結果指導介入操作的進程。閱片者往往需要密切結合臨床資料，綜合應用微生物學、影像學、細胞學、病理學等多學科知識，對標本進行判讀。閱片者既可以是病理科、檢驗科醫師，也可以是臨床醫師，要求其受過系統培訓，并具備豐富的經驗。首先判斷標本是否合格：如觀察到出血、壞死或黏液狀的物質，有效細胞成分少，則提示取材不理想，需實時調整取材位置或取材方法，直至取材成功。若已取得理想標本則可結束操作。取材成功后根據現場快速判讀結果進行標本分流，如果現場見到異形細胞，則初步判斷是否為惡性細胞、可疑惡性細胞，考慮行免疫組化或腫瘤基因檢查，并指導進一步取材；如現場判斷化膿性病變或見到細菌吞噬，初步判斷是否為感染性疾病，考慮行病原學相關檢查和微生物宏基因檢測。

ROSE在介入操作方面具有很多優勢：(1)提高取材診斷陽性率，特別是對病灶小、取材難的病變組織；(2)減少介入操作次數，降低操作并發癥發生風險；(3)對疑難和危重癥患者，ROSE結果可用于指導標本的進一步處置和特殊檢查，為早期診斷、早期治療提供客觀根據；(4)在多學科聯合診斷技術中性價比高，有助于惡性腫瘤的診斷和標本的分流[20]，如用于快速染色的肺癌組織檢材可直接用于二代基因測序[21]。ROSE除了在早期可指導區別惡性、良性病變外，在鑒別部分變態反應性疾病(如嗜酸性粒細胞性支氣管炎和哮喘、嗜酸性粒細胞增多癥)、呼吸系統感染性疾病(炎癥細胞增多)等方面也具有重要作用。

關于傳統ROSE技術的應用價值和局限性，有學者認為：ROSE操作需要操作者具備較強的細胞病理學知識儲備，不應該由臨床醫師開展現場染色、讀片判斷[22]；不合格的ROSE診斷有可能導致穿刺提前結束，導致活檢不成功，有研究結果顯示ROSE并不能提高經支氣管鏡針吸活檢的診斷率[23]。此外，由于受限于染色方法，且操作者經驗和技術水平參差不齊，ROSE判讀結果差異大。同時，操作人員快速識別形態學也有難度，存在一定的主觀誤差，并不能確診，所以ROSE結果所能提供的信息也是局限的[22]。

3 免疫熒光標記染色ROSE技術

鑒于以上傳統ROSE技術的不足，ROSE診斷創新(免疫熒光標記染色ROSE技術)應運而出：從ROSE操作過程中的染色方法方面尋找新的突破口，將免疫熒光染色法的理念引入、融合到傳統ROSE技術中，結合其他新的介入診療手段，提高基于ROSE技術的呼吸介入診斷的靈敏度和特異度。《美國傳染病微生物實驗室診斷方法使用指南》[24]中指出，免疫熒光染色法是診斷真菌引起的血液、心血管系統、中樞神經系統、眼部、頭頸部軟組織、呼吸道、胃腸道、腹腔、骨和關節、泌尿道、生殖器、皮膚和軟組織等的感染最為可靠的方法[24]。中華醫學會病理分會第二十五次學術會議提出，抗酸分枝桿菌熒光染色法診斷兒童結核病感染的靈敏度和特異度更高。肺結核診斷行業標準WS288-2017中增加了熒光染色顯微鏡檢查和兒童肺結核診斷特點內容[25]，能夠更好地為結核感染患兒的確診提供指導依據。熒光染色檢測法用于惡性腫瘤診斷方面的研究[26-27]逐漸受到關注。傳統ROSE技術流程繁多，操作復雜，且無法實現快速精確診斷。采用蛋白熒光標記技術可一步染色操作，1 min內對各類組織和細胞標本進行染色診斷。

免疫熒光染色法主要分三部分：真菌熒光染色(對各類組織和細胞標本中存在的真菌進行基礎菌屬分類)、抗酸熒光染色(對各類組織和細胞標本中存在的抗酸桿菌進行特異性標記)、組織細胞熒光染色(對各類細胞標本中存在的病變細胞進行快速提示，區分炎癥細胞、正常非變異細胞、變異異常細胞)。熒光染色試劑包括：(1)免疫顯色試劑(I型)，用于對組織和細胞標本中各類真菌進行熒光染色標記，一步染色，1 min鏡下觀察，根據形態進行部分菌屬區分。(2)抗酸分枝桿菌檢測試劑，用于對組織和細胞標本中的抗酸桿菌進行熒光染色標記，二步染色，15 min鏡下觀察，標本無須加熱，高度背景反差極易發現抗酸分枝桿菌。(3)組織細胞染色液，用于對組織和細胞進行熒光染色標記，一步染色，1 min鏡下觀察，能針對細胞類型和清晰的細胞學背景進行迅速歸類。熒光染色試劑無毒、無味、無揮發性，常溫避光保存即可。醫務人員可在熒光生物顯微鏡下對熒光染色后的標本進行快速判讀，并現場評價。

與傳統ROSE技術相比，免疫熒光標記染色ROSE技術有以下優勢：(1)熒光快速染色技術操作簡單，檢測時間短，符合快速研判診斷、快速出報告的要求。(2)熒光顯色，靈敏度高，減少漏診發生。(3)特異性熒光標記，形態確切，特異度高，減少假陽性，臨床符合率高。(4)一份標本可同時完成多種檢測，減少臨床反復取材，可提示真菌、結核桿菌、球菌、桿菌和異常病變細胞、炎癥細胞、上皮細胞。

4 小結與展望

傳統染色ROSE技術的應用推進了呼吸介入診斷技術的快速發展，免疫熒光標記染色ROSE技術也逐漸突顯優勢，基于免疫熒光檢測方法的全自動熒光圖像掃描儀(包括有單通量熒光自動型、多通量熒光自動型)可自動掃描判斷，加上在人工智能醫療領域的全方位研究，實現了深度學習、計算機視覺、光電控制等開創性的技術突破。其中NGMAX采用獨創的算法模型，結合自動化掃描設備，形成了一站式軟硬件一體輔助診斷解決方案，用于實現呼吸道病原體和細胞學熒光下人工智能篩查與診斷，準確率突破98%，便于臨床解決更多的疑難雜癥和新的診斷技術挑戰。自動化制片與自動化染色的研究目前正在開展中，不久的將來，隨著人工智能技術的快速發展，有望實現ROSE技術全自動化，推進ROSE技術應用的飛躍變革。