刺激響應(yīng)性共聚物修飾金納米棒的制備及其抗腫瘤性能

郭 敏， 侯光暉， 胥偉軍， 錢(qián)軍民

（西安交通大學(xué)金屬材料強(qiáng)度國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710049）

化療是臨床腫瘤治療的基本手段之一，但其存在劑量依賴性的毒副作用和耐藥性等問(wèn)題[1]。近年來(lái)，光熱療法（PTT）、光動(dòng)力療法和免疫療法等治療模式方興未艾[2-5]。然而，腫瘤存在多樣性、異質(zhì)性和轉(zhuǎn)移性等特點(diǎn)，單一治療模式難以徹底治愈腫瘤。因此，基于不同治療模式的聯(lián)合治療已成為腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床治療的主流方向。

PTT 是一種激光熱療抗腫瘤技術(shù)，具有特異性高、療效好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，但也存在腫瘤組織中熱分布不均勻的問(wèn)題，難以完全清除腫瘤[3]，而化療能有效克服這一缺點(diǎn)。PTT 的熱效應(yīng)可改善腫瘤血管通透性，促進(jìn)藥物擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)小劑量藥物的高效治療[6,7]。因此，PTT 與化療聯(lián)合是一種很有開(kāi)發(fā)前景的抗癌方法。在目前開(kāi)發(fā)的光熱材料中，金納米棒（GNR）因具有毒性小、光熱轉(zhuǎn)換效率高等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[6,8,9]。因此，將GNR 與化療藥物聯(lián)合治療有望取得“1+1＞2”的協(xié)同治療效果。然而，GNR 用于聯(lián)合治療存在3 大缺點(diǎn)：（1）光滑表面導(dǎo)致載藥能力低；（2）GNR 制備過(guò)程中表面殘留的表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）有明顯的細(xì)胞毒性[10,11]；（3）在鹽溶液中，GNR 表面的CTAB 雙分子層易被破壞，導(dǎo)致GNR 聚集析出。

為解決上述問(wèn)題，研究者已開(kāi)發(fā)出多種GNR 表面改性方法，實(shí)現(xiàn)腫瘤的光熱-化療聯(lián)合治療。例如，利用介孔SiO2[12,13]或氧化石墨烯[14]修飾GNR，可增強(qiáng)載藥能力；通過(guò)在GNR 表面修飾離子型聚合物，可經(jīng)靜電作用吸附藥物[15,16]。然而，這些物理方式裝載的藥物在載體上穩(wěn)定性差，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)易發(fā)生過(guò)早釋放，難以有效到達(dá)腫瘤。相比之下，通過(guò)環(huán)境敏感的化學(xué)鍵偶聯(lián)藥物是一種理想的藥物裝載方式，既可防止過(guò)早釋放又能響應(yīng)腫瘤微環(huán)境釋放藥物。嵌段共聚物因具有分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活和易功能化等優(yōu)點(diǎn)，已被開(kāi)發(fā)用于藥物/基因傳遞[17,18]。然而，由嵌段共聚物和GNR 構(gòu)建納米偶聯(lián)物用于腫瘤光熱-化療聯(lián)合治療的研究很少。

基于此，本文以1-叔丁氧基羰基-2-丙烯酰肼（Boc-AH）、N-（3,4-二羥基苯乙基）丙烯酰胺（AD）和聚乙二醇甲醚丙烯酸酯（mPEGA）為單體，利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合方法及脫除保護(hù)基團(tuán)過(guò)程，合成了一種具有仿貽貝黏性的聚乙二醇（PEG）化嵌段共聚物，即聚丙烯酰肼-聚N-（3,4-二羥基苯乙基）丙烯酰胺-聚單甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯（PAH-b-PAD-b-PmPEGA，縮寫(xiě)為HDP）。該共聚物可通過(guò)其多巴胺結(jié)構(gòu)中的鄰苯二酚基偶聯(lián)于GNR 表面（HDP-GNR），再經(jīng)其酰肼基團(tuán)與化療藥物阿霉素（DOX）中羰基形成酸敏感的腙鍵裝載DOX，獲得納米藥物（HDP-GNR-DOX），可實(shí)現(xiàn)乳腺癌的光熱-化療聯(lián)合治療。該納米藥物具有PEG 外殼，既可防止顆粒聚集又可使納米體系穩(wěn)定懸浮于水性體系中。納米藥物經(jīng)胞吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，可響應(yīng)其酸性環(huán)境使腙鍵斷裂，釋放DOX；在近紅外（NIR）光照射下，可實(shí)現(xiàn)光熱-化療聯(lián)合治療。該納米體系的理化特性研究和體外細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)表明，該納米體系在腫瘤光熱-化療聯(lián)合治療中顯現(xiàn)出巨大的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

聚乙二醇單甲醚（mPEG，Mw=2×103）、三氟乙酸（TFA）、2,2'-偶氮異丁腈（AIBN）：分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；高糖培養(yǎng)基（DMEM）、青霉素/鏈霉素、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（質(zhì)量濃度為2.5 g/L）：生化級(jí)，美國(guó)Hyclone 公司；阿霉素鹽酸鹽（DOX·HCl）：分析純，大連美侖生物技術(shù)有限公司；4',6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、鈣黃綠素AM/PI 染色試劑盒和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化銨（MTT）：生化級(jí)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑：分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)西安）；人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)中心。

1.2 測(cè)試與表征

通過(guò)核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司AVANCE Ⅲ 600 MHz 型）檢測(cè)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；用傅里葉變換紅外光譜儀（日本Shimadzu IR 公司 Prestige-21 型）驗(yàn)證HDP-GNR 的合成；利用分光光度計(jì)（中國(guó)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1810 型）表征GNR 經(jīng)聚合物修飾前后的紫外-可見(jiàn)吸收（UV-Vis）光譜；通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL 公司JEM-2 100 Plus 型）觀察納米顆粒的形貌；利用納米激光粒度儀（英國(guó)Malvern公司Zetasizer Nano-ZS90 型）測(cè)量納米顆粒的Zeta 電位和流體力學(xué)尺寸，其原理是動(dòng)態(tài)光散射（DLS）法；利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS，德國(guó)Spectro 公司Arcos 型）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的金含量；利用紅外熱像儀（美國(guó)FLIR 公司E60 型）監(jiān)測(cè)溫度。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.2 HDP-GNR-DOX 的合成 首先，采用種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法制備表面包覆有CTAB 的GNR (CTAB-GNR)[22]。然后，在50 mL HDP 溶液（1 mg/mL）中加10 mL GNR 懸液（200 μg/mL），反應(yīng)24 h 后離心收集HDP-GNR。接著，將4 mL DOX 溶液（0.5 mg/mL）加入50 mL HDP-GNR 懸液（Au 的質(zhì)量濃度為30 μg/mL）中，25 ℃攪拌24 h。最后，經(jīng)離心、洗滌得到HDP-GNR-DOX，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 HDP-GNR-DOX 納米藥物的制備及其在細(xì)胞中的運(yùn)輸示意圖Fig. 1 Schemic diagram of preparation and intracellular transport of HDP-GNR-DOX nanodrug

1.3.3 穩(wěn)定性及體外藥物釋放行為 將HDP-GNR-DOX 和CTAB-GNR 分別分散于于水和磷酸鹽緩沖液（PBS）（10 mmol/L，pH=7.4）中，在預(yù)設(shè)時(shí)間測(cè)試樣品的UV-Vis 吸收光譜。

將HDP-GNR-DOX 放入透析袋（截留分子量為1 000）中，然后置于pH 分別為5.0、6.5 或7.4 的PBS 中。定期取2.0 mL 透析液檢測(cè)DOX 的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為 580 nm），根據(jù)DOX的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物釋藥量。

1.3.4 光熱轉(zhuǎn)換研究 為探究HDP 修飾和DOX 裝載對(duì)GNR 光熱性能的影響，分別將1.0 mL 金含量相同的CTAB-GNR、HDP-GNR 和HDP-GNR-DOX 懸液加入離心管中，在功率為2.0 W/cm2的NIR 光下照射10 min，用紅外熱像儀監(jiān)測(cè)溫度。為研究金的質(zhì)量濃度（ρ（Au））對(duì)光熱性能的影響，將1.0 mL 的HDP-GNR-DOX 懸液（ρ（Au）分別為20、30、40、50 μg /mL）經(jīng)NIR 光（2.0 W/cm2）照射10 min，監(jiān)測(cè)溫度變化。為探究NIR 光功率對(duì)光熱性能的影響，將ρ（Au）為20 μg/mL 的HDP-GNR-DOX 懸液經(jīng)不同NIR 光功率（1.0、2.0 W/cm2和3.5 W/cm2）照射10 min，記錄溫度變化。為檢測(cè)光穩(wěn)定性，對(duì)HDP-GNR-DOX 懸液進(jìn)行3 次加熱冷卻循環(huán)（Au 的質(zhì)量濃度為20 μg /mL，NIR 光的功率為2.0 W/cm2）實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7 用含有 FBS（體積分?jǐn)?shù)為10%）和青霉素/鏈霉素（體積分?jǐn)?shù)為1%）的DMEM 培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。

1.3.6 體外細(xì)胞攝取研究 將細(xì)胞接種于24 孔板（每孔5×104個(gè)細(xì)胞）中，培養(yǎng)24 h 后用HDP-GNR-DOX 或等物質(zhì)的量游離DOX 處理，然后繼續(xù)培養(yǎng)1、4、12 h，經(jīng)DAPI 染色后用激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica 公司TCS SP8 STED 3X 型）觀察。

將細(xì)胞接種于6 孔板（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）中，用HDP-GNR-DOX 或等物質(zhì)的量的游離DOX 處理1、4、12 h 后離心收集細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀（FACS Canto II 型）定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DOX 的熒光強(qiáng)度。

將HDP-GNR-DOX 與細(xì)胞共孵育4、12 h 后，制作TEM 樣品。利用透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司H7650 型）觀察細(xì)胞內(nèi)GNR 的含量和分布。

1.3.7 體外抗癌效果 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞毒性。將細(xì)胞接種于96 孔板（每孔1×104個(gè)細(xì)胞）中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的納米顆粒處理后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度。將細(xì)胞接種于24 孔板（每孔5×104個(gè)細(xì)胞）中，分別用不同納米顆粒處理后進(jìn)行鈣黃綠素AM/PI 染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡/壞死，將細(xì)胞接種于6 孔板（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）中，經(jīng)不同納米顆粒處理后進(jìn)行Annexin V-EGFP/PI 染色，用流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。

3) 焊縫XRD物相分析和斷口EDS能譜掃描表明焊縫中含有大量的脆性相Mg2Al3、Mg17Al12，大量的脆性相決定了斷口形貌圖中斷裂面主要以解理斷裂為主，有少量的韌窩存在，脆性相的存在嚴(yán)重降低了接頭質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HDP-GNR-DOX 的表征

圖2 為合成HDP 時(shí)不同階段產(chǎn)物的1H-NMR 譜圖。在圖2（a）中，1.62（γ）、1.24（α）、1.06（α）和0.85（α）處的特征峰歸屬于DACT 上的質(zhì)子，3.45（ε）、1.83～2.27（δ,ε）和1.42（β）處的特征峰歸屬于Boc-AH 上的質(zhì)子，表明P（Boc-AH）成功合成。在圖2（b）中出現(xiàn)了多巴胺結(jié)構(gòu)中質(zhì)子的特征峰（6.31～6.72（ι）, 2.89（θ）和2.74（η）），表明AD 段成功合成。在圖2（c）中出現(xiàn)了PEG 中亞甲基質(zhì)子信號(hào)（4.23（κ）, 3.52（κ））和甲氧基的質(zhì)子信號(hào)（3.25（λ）），證實(shí)P（Boc-AH）-b-PAD-b-PmPEGA 成功合成。在圖2（d）中，Boc 基團(tuán)的質(zhì)子信號(hào)（1.42（γ））強(qiáng)度顯著降低，同時(shí)出現(xiàn)了酰肼基團(tuán)的質(zhì)子信號(hào)（3.68～4.03（β）），表明Boc 基團(tuán)有效脫除。以上結(jié)果證實(shí)HDP 成功合成。

圖2 樣品的1H-NMR 譜圖Fig. 2 1H-NMR spectra of samples

利用FT-IR 光譜驗(yàn)證HDP 在GNR 表面的修飾，結(jié)果見(jiàn)圖3（a）。與CTAB-GNR 相比，HDP-GNR 的FTIR 譜圖中出現(xiàn)了HDP 的2 個(gè)特征吸收峰（1 648、1 087 cm?1），表明GNR 已被HDP 成功修飾。UV-Vis 譜圖（圖3（b））顯示，GNR 經(jīng)HDP 修飾后，其縱向等離子體共振（LSPR）吸收峰從804 nm 紅移至814 nm，這可能是少量GNR 聚集所致。相比之下，DOX 裝載不影響LSPR 吸收峰位置。熒光法測(cè)得納米藥物中DOX 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為8.1%。研究表明，納米粒子在體內(nèi)的行為取決于其粒徑、電荷、形貌等性質(zhì)[23,24]。納米藥物的流體力學(xué)粒徑和Zeta 電位如圖3（c）所示，可以看出GNR 粒徑呈雙峰分布，這是因?yàn)镚NR 具有2 種不同的平動(dòng)擴(kuò)散系數(shù)和轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散系數(shù)[25,26]。通常，大尺寸峰反映GNR 的真實(shí)流體力學(xué)粒徑，而小尺寸峰則代表粒子的旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散。經(jīng)HDP 表面修飾和DOX 裝載后，GNR 平均粒徑從24.6 nm 依次增加至31.3 nm 和33.9 nm。同時(shí)，Zeta 電位從36.8 mV 降至?14.4 mV（圖3（d））。這些結(jié)果表明，GNR 表面的CTAB 已被HDP 取代。

圖3 樣品的（a） FT-IR 譜圖、（b） UV-Vis 吸收光譜、（c）流體力學(xué)粒徑和（d） Zeta 電位Fig. 3 （a） FT-IR spectra, （b） UV-Vis spectra, （c） hydrodynamic sizes and （d） Zeta potentials of samples

圖4 給出了GNR 修飾前后的結(jié)構(gòu)和形貌，可以看出，與未修飾的GNR 相比，HDP 修飾后GNR表面出現(xiàn)了厚度約為4.5 nm 的聚合物層，直接證實(shí)HDP 成功修飾于GNR 表面。

圖4 （a） CTAB-GNR 和（b） HDP-GNR 的TEM 圖像Fig. 4 TEM images of （a） CTAB-GNR and （b） HDP-GNR

2.2 穩(wěn)定性及體外藥物釋放行為

納米顆粒在生理?xiàng)l件下呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性是其應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前提。研究表明，GNR 聚集會(huì)引起長(zhǎng)徑比改變，導(dǎo)致LSPR 吸收峰和溶液顏色隨之改變。從CTAB-GNR 和HDP-GNR-DOX 在PBS 和水中的UV-Vis 吸收光譜和宏觀照片（圖5（a））可以看出，CTAB-GNR 在水中呈紫紅色，而在PBS 溶液中變?yōu)闊o(wú)色；相應(yīng)地，兩者的UV-Vis 光譜截然不同。這些結(jié)果表明，CTAB-GNR 在PBS 中不穩(wěn)定。這可能是由于鹽溶液中離子破壞了GNR 表面活性劑CTAB 雙分子層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致GNR 聚集。而HDP-GNR-DOX 在PBS 和水介質(zhì)中均呈透亮的紫紅色，UV-Vis 吸收光譜亦無(wú)明顯差異，表明該納米藥物具有良好的懸浮穩(wěn)定性。

圖5（b）所示為納米藥物在不同pH 環(huán)境中釋放DOX 的動(dòng)力學(xué)曲線。很明顯，DOX 釋放量呈現(xiàn)pH 依賴性。當(dāng)pH=7.4 時(shí)，5 d 內(nèi)僅釋放12%的DOX，而當(dāng)pH=5.0 時(shí)，DOX 釋放速率顯著加快，24 h 內(nèi)釋放量已達(dá)55%，5 d 時(shí)釋放量達(dá)到72%。上述結(jié)果表明，納米藥物既能在正常生理pH 下保持穩(wěn)定，又能在腫瘤細(xì)胞的酸性環(huán)境中快速釋放DOX，起到提高療效和降低毒副作用的效果。

圖5 （a）CTAB-GNR 和HDP-GNR-DOX 在PBS 和水中的UV-Vis 吸收光譜和照片；（b）HDP-GNR-DOX 釋放DOX 的動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 5 （a） UV-Vis spectra and photographs of CTAB-GNR and HDP-GNR-DOX in water and PBS;（b） Release profiles of DOX from HDPGNR-DOX

2.3 光熱轉(zhuǎn)換能力

HDP-GNR-DOX 的光熱轉(zhuǎn)換能力如圖6 所示。圖6 可知，表面修飾和DOX 裝載對(duì)GNR 光熱轉(zhuǎn)換能力的影響有限（圖6（a））。在2.0 W/cm2的808 nm NIR 光輻照5 min 后，體系溫度升高約30 ℃。HDP-GNRDOX 的光熱轉(zhuǎn)換能力與其質(zhì)量濃度和NIR 光強(qiáng)呈正相關(guān)性（圖6（b）和6（c））。此外，HDP-GNR-DOX 展現(xiàn)出優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性（圖6（d）），3 次光照-冷卻循環(huán)中的最高溫度基本不變。

圖6 （a）樣品的光熱性能；（b） HDP-GNR-DOX 濃度和（c） NIR 光功率對(duì)光熱效果的影響；（d） HDP-GNR-DOX 光熱性能的穩(wěn)定性Fig. 6 （a） Photothermal performance of samples; Effects of （b） HDP-GNR-DOX concentration and （c） NIR power on photothermal performance; （d）Photothermal stability of HDP-GNR-DOX

2.4 細(xì)胞對(duì)納米藥物的攝取

利用透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡研究了納米藥物被細(xì)胞攝取及細(xì)胞內(nèi)分布情況。由圖7（a）可以看出，納米藥物可經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并有效轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)；隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)納米藥物的攝取量明顯增加。這一結(jié)果被流式細(xì)胞術(shù)的定量檢測(cè)結(jié)果（圖7（b））和激光共聚焦顯微鏡定性表征（圖8（a）和圖8（b））證實(shí)。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果和激光共聚焦顯微鏡照片表明，游離DOX 進(jìn)入細(xì)胞的速率比HDPGNR-DOX 更快，在本研究的觀察時(shí)間點(diǎn)，游離DOX 的熒光主要位于細(xì)胞核，而HDP-GNR-DOX 的熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)。這是因?yàn)橛坞xDOX 經(jīng)擴(kuò)散作用直接進(jìn)入細(xì)胞，比納米藥物進(jìn)入細(xì)胞的胞吞作用更加高效[27]。

圖7 HDP-GNR-DOX 處理MCF-7 的（a）TEM 圖像和（b）細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度Fig. 7 （a） TEM images and （b） fluorescence intensity of MCF-7 treated with HDP-GNR-DOX

圖8 （a）HDP-GNR-DOX 和（b）游離DOX 處理MCF-7 不同時(shí)間后DOX 的細(xì)胞內(nèi)分布Fig. 8 Intracellular distribution of DOX in MCF-7 incubated with （a） HDP-GNR-DOX and （b） free DOX

2.5 細(xì)胞相容性

HDP-GNR 的細(xì)胞毒性如圖9（a）所示。當(dāng)ρ（Au）＞5 μg/ mL 時(shí)，CTAB-GNR 處理的細(xì)胞活性開(kāi)始明顯下降，而當(dāng)ρ（Au）=40 μg/ mL 時(shí)，細(xì)胞成活率低于30%，表明CTAB-GNR 具有明顯的細(xì)胞毒性，主要?dú)w因于CTAB 的細(xì)胞毒性。相比之下，HDP-GNR 細(xì)胞存活率仍高于80%，說(shuō)明HDP-GNR 細(xì)胞相容性優(yōu)異。

圖9 （a） HDP-GNR 的細(xì)胞毒性；（b）不同制劑處理MCF-7后的細(xì)胞活力；（c）光熱化療（HDP-GNR-DOX + NIR）聯(lián)合療效與單純PTT（HDP-GNR + NIR）和單純化療（HDP-GNR-DOX）疊加療效的比較Fig. 9 （a） Cytotoxicity of HDP-GNR; （b） Viability of MCF-7 treated with different formulations; （c） Comparison of combined efficacy of photothermal chemotherapy (HDPGNR-DOX + NIR) and additive efficacy of single PTT((HDPGNR + NIR) and chemotherapy (HDP-GNR-DOX)

2.6 體外聯(lián)合治療

不同制劑處理MCF-7 后的細(xì)胞活力如圖9（b）所示。由圖可以看出，在每種制劑中，細(xì)胞存活率均表現(xiàn)出濃度依賴性；游離DOX+NIR 組的細(xì)胞存活率與游離DOX 組的相當(dāng)，說(shuō)明功率為2.0 W/cm2的NIR 光輻照對(duì)細(xì)胞活性影響很小。在相同功率NIR 光照射下，HDP-GNR 組細(xì)胞毒性明顯，表明其光熱效應(yīng)能有效殺死細(xì)胞。HDP-GNR-DOX+NIR組的細(xì)胞存活率最低，表明聯(lián)合治療效果比單一治療好。為探究HDP-GNR-DOX 中兩種治療模式是否存在協(xié)同效應(yīng)，考察了不同劑量下聯(lián)合治療（HDPGNR-DOX+NIR）與單純PTT（HDP-GNR+NIR）和單純化療（HDP-GNR-DOX）疊加效果的差異（圖9（c））。結(jié)果表明，當(dāng)ρ（Au）＜20 μg/mL 時(shí)，前者的細(xì)胞殺傷效果顯著好于后者，表明HDP-GNR-DOX 中兩種治療方式具有協(xié)同抗腫瘤效果。當(dāng)ρ（Au）＞20 μg/mL時(shí)，協(xié)同效率與疊加效率差異減小，這可能是由于藥物質(zhì)量濃度較大時(shí)，單一治療模式已具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷力，掩蓋了協(xié)同治療的效果。其協(xié)同機(jī)制可能是HDP-GNR+NIR 治療中的高熱效應(yīng)加速了DOX 擴(kuò)散并增加了癌細(xì)胞對(duì)DOX 的敏感性[7,18]。

不同劑型對(duì)MCF-7 的毒性如圖10（a）所示。HDP-GNR 組細(xì)胞死亡不明顯，說(shuō)明其細(xì)胞毒性可忽略；游離DOX 組僅有小部分細(xì)胞死亡；HDPGNR+NIR 組則出現(xiàn)明顯的活/死細(xì)胞分界線，NIR光輻照區(qū)域顯示出微弱綠色熒光，表明細(xì)胞幾乎全部死亡，證明HDP-GNR+NIR 效果優(yōu)異；HDP-GNRDOX+NIR 組除了NIR 光照射區(qū)域展現(xiàn)出更徹底的細(xì)胞消融，非輻照區(qū)域也出現(xiàn)了明顯的死亡細(xì)胞。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HDP-GNR-DOX 組在腫瘤光熱-化療聯(lián)合治療中的優(yōu)異效果。

隨后對(duì)不同制劑處理后的MCF-7 進(jìn)行Annexin V-EGFP/PI 染色，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。如圖10（b）所示，HDP-GNR 組的細(xì)胞凋亡率極低，再次證實(shí)納米載體優(yōu)異的細(xì)胞相容性。而HDP-GNR-DOX +NIR 組細(xì)胞凋亡率顯著高于單一的化療（游離DOX 和HDP-GNR-DOX）或HDP-GNR + NIR 治療組，證實(shí)HDPGNR-DOX 在NIR 光照射下能高效誘導(dǎo)MCF-7 凋亡。

圖10 不同劑型對(duì)MCF-7 的（a）毒性和（b）凋亡的影響Fig. 10 （a） Fluorescence images and （b） apoptosis of MCF-7 treated with different formulations

3 結(jié) 論

（1）成功合成了具有仿貽貝黏附性和能經(jīng)腙鍵裝載DOX 的三嵌段共聚物。

（2）共聚物可經(jīng)鄰苯二酚基和Au 配位作用修飾于GNR 表面，其DOX 的載藥率達(dá)8.1%。

（3）該納米藥物在模擬的生理pH 下穩(wěn)定性良好，可實(shí)現(xiàn)光熱-化療協(xié)同殺傷乳腺癌細(xì)胞的目的。