白蛋白/透明質酸納米顆粒制備及遞送順鉑效果

王太兵， 李 穎， 賈卓翰， 郭 敏， 胥偉軍， 錢軍民， 鎖愛莉

（1. 西安交通大學金屬材料強度國家重點實驗室，西安710049；2. 西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科，西安 710061）

癌癥治療是世界性難題，化療是癌癥治療的基本手段。化療藥物順鉑（Cis）廣泛應用于各種腫瘤的臨床治療，但其療效受制于嚴重的毒副作用和耐藥問題，如慢性神經毒性、急性腎毒性等[1,2]。目前，開發多功能的納米遞送體系已成為增加藥物在腫瘤中的積累和降低毒副作用的重要研究方向[3,4]。然而，與疏水性的紫杉醇或阿霉素可載于納米膠束中不同，水溶性的順鉑無法直接裝載于納米膠束中，需要對順鉑進行改性方能裝載于納米膠束中，但這會改變藥物代謝動力學，影響療效[5]。因此，迫切需要開發出能直接裝載順鉑的新型納米遞送體系。

透明質酸（HA）是生物相容性優異、無免疫原性、可生物降解的天然多糖，并且能識別、靶向高表達表面抗原分化簇44（CD44）受體或透明質酸結合蛋白1 的腫瘤細胞，是綜合性能優異的藥物載體材料[6-8]。有研究表明，HA 的羧基能與順鉑發生絡合反應，形成大分子藥物或納米凝膠，有助于提高順鉑的抗腫瘤效果[9]。此外，通過靜電作用和絡合反應分別將疏水性的阿霉素和親水性順鉑裝載于HA 上，可經自組裝過程形成納米藥物，在提高乳腺癌治療效果的同時可降低毒副作用[10,11]。然而，利用順鉑-羧基絡合方式裝載順鉑，其裝載過程費時，且順鉑裝載量和釋放過程不可控。

本研究提出以白蛋白為模板，以酰肼化透明質酸（HHA）和醛基化透明質酸（AHA）為原料，經非溶劑化和原位交聯反應，制成具有互穿網絡結構的白蛋白/透明質酸（B-HA）納米載體，B-HA 再經順鉑-酰肼配位化學作用將順鉑裝載于納米載體上，得到B-HA/Cis 納米藥物。對該納米藥物的理化性質和殺傷肝癌（HepG2）細胞的效果進行了系統研究。結果表明，B-HA 納米載體可高效裝載順鉑，B-HA/Cis 對肝癌細胞有靶向殺傷作用。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

HA：Mw≈8×103，生物試劑，山東華熙福瑞達生物醫藥有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：生物試劑，Sigma-Aldrich 公司；Cis：純度98%，昆明貴研藥業有限公司；無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；HepG2細胞：西安交通大學醫學院提供；胎牛血清（FBS）：生物試劑，碧云天生物技術有限公司；高糖（DMEM）培養基：生物試劑，上海麥克林生化科技有限公司；多聚甲醛：生物試劑，w=4%，北京鼎國昌盛生物技術有限公司；MTT 試劑盒：碧云天生物技術有限公司；Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒：上海七海復泰生物科技有限公司。

1.2 測試與表征

采用瑞士BRUKER 公司Bruker 400M 型核磁共振波譜儀測試AHA 和HA 的核磁共振氫譜（1H-NMR），1H-NMR 的分辨率小于0.45 Hz，靈敏度大于900；采用美國Nicolet 公司AVATAR 360 型紅外光譜（FT-IR）儀分析納米載體的特征吸收峰，紅外光譜的分辨率為4 cm?1，記錄范圍從400 cm?1到4 000 cm?1；采用美國PerkinElmer 公司NexION 350D 型電感耦合等離子體-質譜（ICP-MS）儀檢測鉑元素含量，計算載藥率和載藥效率；采用英國Malven 公司Nano-ZS90 型激光粒度儀/Zeta 電位儀測定納米顆粒的粒徑和Zeta 電位，動態光散射（DLS）法測試條件為散射角90°和溫度25 ℃；采用日本NEC 公司JEM-200CX 型透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米藥物形貌；采用德國徠卡顯微系統TCS SP8 型共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察細胞對納米藥物的攝取并拍照；采用美國Agilent 公司ACEA NovoCyte 型流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 白蛋白/透明質酸納米藥物的制備

HHA 由本課題組合成，具體見文獻[12]。AHA 用高碘酸鈉氧化法合成，根據文獻[13]進行。納米載體制備過程如下：將100 mg 白蛋白和50 mg HHA 溶于pH=9 的12.5 mL 水中，然后依次滴加50 mL 無水乙醇（速率為1 mL/min）和3 mL 質量濃度為20 mg/mL 的AHA 溶液，經離心、洗滌和冷凍干燥收集納米載體。為裝載順鉑，在超聲作用下將40 mg 納米載體分散于10 mL 水中，然后加入10 mL 質量濃度為2 mg/mL 的順鉑水溶液，于37 ℃反應12 h 后進行冷凍干燥，得到所需納米藥物。

1.4 體外藥物釋放

配制20 mL 質量濃度為1 mg/mL 納米藥物懸液，均分裝入4 個透析袋（截留分子量為3 000）中，分別浸沒在200 mL 的磷酸鹽緩沖（PBS）溶液透析液中，置于搖床上振蕩。PBS 透析液的pH 為5.5 或7.4，含有或不含濃度為10 mmol/L 的谷胱甘肽（GSH）。在設定時間節點，取出2 mL 透析液，并補充2 mL 新鮮的透析液。取出透析液，用ICP-MS 檢測鉑含量，計算出相應的藥物釋放率。

1.5 納米載體的細胞攝取

將1×105個HepG2 細胞接種在激光共聚焦皿中培養24 h，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的納米載體（用量為20 μg/mL）共培養4、12 h 或24 h 后，用移液槍吸棄培養基，加入適量PBS 溶液清洗3 次；將細胞經w=4%的多聚甲醛溶液固定30 min，清洗干凈后再用4,6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）染液染色10 min，清洗后使用CLSM 觀察細胞內熒光。

1.6 細胞毒性及凋亡測試

通過MTT 法測定了納米載體、游離順鉑和納米藥物對HepG2 細胞的毒性：將HepG2 細胞以每孔1×104個的濃度接種在96 孔板中，培養24 h 后分別用不同濃度梯度的納米載體、游離順鉑和納米藥物孵育48 h。配制5 mg/mL 的MTT 溶液，每個孔中加入20 μL MTT，將96 孔板繼續置于培養箱中培養4 h。隨后將培養板取出，使用移液器將每個孔中的培養基吸棄，向每個孔中加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），在恒溫搖床（140 r/min）中避光振蕩10 min。最后將96 孔板置于酶標儀上測定490 nm 處的吸光度，計算出細胞存活率。

采用流式細胞術研究納米藥物對腫瘤細胞凋亡的影響：將HepG2 細胞以每孔5×105個的濃度接種到6孔板中，培養24 h 后加入游離順鉑、B-HA 納米顆粒、去靶向B-HA/Cis 納米藥物、靶向B-HA/Cis 納米藥物，再孵育48 h 后進行消化和離心分離，最后將收集的細胞利用復合緩沖液制成懸浮液，經Annexin V-EGFP/PI染色后進行流式細胞術，檢測細胞凋亡情況。

2 結果與討論

2.1 AHA 的合成與表征

利用經典的高碘酸鈉氧化法將HA 制成氧化度為40%的AHA，HA 醛基化前后的1H-NMR 譜見圖1。與圖1（a）中HA 的1H-NMR 譜圖相比，AHA 的1H-NMR 譜圖（圖1（b））不僅具有透明質酸中糖環結構上質子的特征峰（3.3～4.4），還在4.8～5.0 處出現了醛基質子的特征峰，這證實了AHA 的成功合成[14]。

圖1 在D2O 中測得的HA（a）和AHA（b）的1H-NMR 譜圖Fig. 1 1H-NMR spectra of HA （a） and AHA （b） in D2O

2.2 納米載體的FT-IR 分析

圖2 給出了BSA、HHA 和B-HA 納米載體的FT-IR 譜圖。在納米載體的FT-IR 譜圖中，1 640、1 540 cm?1處的吸收峰分別歸屬于BSA 中肽鍵的C=O 伸縮振動和N-H 彎曲振動[15]，其中1 540 cm?1處的吸收峰覆蓋了HHA 中酰肼基團的特征吸收峰（1 565 cm?1）；以3 416 cm?1為中心的寬吸收峰歸屬于O-H 和N-H 的伸縮振動。這些結果證實，B-HA 納米載體是由BSA 和HHA 復合而成的。

圖2 BSA、B-HA 和HHA 的FT-IR 譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of BSA, B-HA and HHA

2.3 納米藥物的粒徑、形貌和Zeta 電位

在制備B-HA 納米載體的過程中，BSA 和HHA 的濃度，以及它們的質量比是決定B-HA 納米載體粒徑和Zeta 電位的關鍵因素?？紤]到粒徑是納米載體經腫瘤組織高效滲透長滯留（EPR）效應實現被動靶向的決定性因素，確定出了制備B-HA 納米載體的最優配方和工藝條件。在此條件下獲得的納米載體的流體動力學尺寸和Zeta 電位分別為145 nm 和?23.0 mV，在裝載順鉑后B-HA/Cis 的平均粒徑略微增加至150 nm，Zeta 電位升高至?15.1 mV，見圖3（a）。該結果表明，納米藥物的流體動力學尺寸仍處于易經腫瘤組織EPR 效應積累于腫瘤的粒徑范圍（小于200 nm）內[16,17]，而納米藥物荷負電則可避免其被內質網系統清除，有利于經長循環靶向積累于腫瘤中[18]。由圖3（b）中的TEM 照片可以看出，B-HA/Cis 納米藥物呈近圓形形貌，其粒徑均一性小于DLS 的結果。造成這種差異的原因為，納米藥物中透明質酸對光的散射作用極弱，難以在DLS的結果中得到反映，DLS 結果主要為粒徑均一的球形BSA 顆粒的粒徑，故粒徑分布較窄；而在以TEM 觀察樣品時，能看到納米藥物顆粒的全貌（含HA 和BSA），粒徑均一性有所降低。

圖3 納米藥物的平均粒徑和Zeta 電位（a）以及TEM 照片（b）Fig. 3 Average size and Zeta potential（a） and TEM image（b） of nanodrugs

2.4 順鉑釋放行為

本文制得納米藥物的載藥率和載藥效率分別為10.8%和90.0%，顯著高于文獻中的相應數據[19]，這主要歸因于采用的新型鉑-酰肼配位方法。為探究納米藥物在腫瘤微環境中釋放順鉑的行為，利用PBS 模擬腫瘤細胞內微環境中的酸性（pH=5.5）和還原性（GSH 濃度為10 mmol/L），順鉑釋放行為見圖4。由圖4可以看出，在中性溶液（pH=7.4）中，72 h 內順鉑釋放率不到27.6%。相比之下，酸性或還原性環境顯著提高了順鉑的釋放速率，72 h 的釋放率分別達到47.3%和56.4%；而在酸性/還原性環境中，順鉑釋放最快，釋放率達到76.0%。結果表明，B-HA/Cis 納米藥物可以響應腫瘤細胞內微環境實現藥物釋放，從而提高療效。納米藥物具有刺激響應性藥物釋放行為的主要原因為，順鉑與載體之間是通過對酸敏感的配位鍵和對還原性敏感的二硫鍵連接的，可分別響應酸性和還原性斷裂，從而釋放順鉑[20,21]。因此，B-HA/Cis 納米藥物具有酸性/還原性雙重敏感性釋放順鉑的特性。

圖4 納米藥物在腫瘤細胞模擬環境中釋放順鉑的行為Fig. 4 Release behaviors of cisplatin from nanodrug in simulated tumor cellular environments

2.5 納米載體的細胞攝取行為

為觀察HepG2 細胞對B-HA 納米載體的攝取行為，利用FITC 對納米載體進行了綠色熒光標記，用其處理HepG2 細胞，細胞攝取B-HA 納米載體的效果見圖5。由圖5 可以看出，隨培養時間延長，細胞中綠色熒光強度增加，表明細胞攝取了更多的B-HA 納米載體，其主要原因是B-HA 納米載體上的透明質酸對HepG2 細胞過表達的CD44 受體有特異性結合功能[22]?？梢姡珺-HA/Cis 納米藥物在肝癌靶向治療中具有開發潛力。

圖5 FITC 標記的B-HA 納米載體處理HepG2 細胞的CLSM照片Fig. 5 CLSM images of HepG2 cells incubated with FITC-labeled B-HA nanocarriers

2.6 納米藥物對HepG2 細胞增殖/凋亡的影響

利用MTT 法評價了B-HA 納米載體的細胞毒性和B-HA/Cis 納米藥物殺傷HepG2 細胞的能力，結果如圖6 所示。由圖6（a）可以看出，隨納米載體濃度增加，細胞存活率有所下降，但即使納米載體質量濃度高達160 μg/mL 時細胞存活率仍高于80%，這表明納米載體的細胞毒性微乎其微。納米載體良好的細胞相容性主要歸因于原料BSA 和HA 的生物相容性優異。從圖6（b）可以看出，B-HA/Cis 納米藥物對HepG2 細胞的殺傷效果呈現顯著的濃度依賴性，其半抑制濃度（IC50）高于游離順鉑的IC50；當順鉑含量相同時，納米藥物殺傷HepG2 細胞的效果略低于游離順鉑，這是因為游離順鉑可經擴散直接進入細胞內發揮作用，而納米藥物在進入細胞后需要一定時間釋放順鉑，造成其殺傷效果滯后于游離順鉑。為驗證這一猜測，評價了順鉑或納米藥物與HepG2 細胞共孵育不同時間后的殺傷效果，結果見圖6（c）。可以看出，兩種用藥方式對HepG2 細胞的殺傷效果均隨孵育時間的延長而增強。值得注意的是，在孵育24 h 和48 h 時，納米藥物的殺傷效果略低于游離順鉑，而72 h 時納米藥物的殺傷效果則優于游離順鉑。上述結果證實了B-HA/Cis 納米藥物在細胞內釋放順鉑需要一定時間的猜測。

圖6 B-HA 納米載體的體外細胞毒性（a）、納米藥物的IC50 值（b）及納米藥物處理HepG2 細胞的殺傷效果（c）Fig. 6 In vitro cytotoxicity of B-HA nanocarrier （a）, IC50 of nanodrug （b） and killing effect of nanodrug on HepG2 cells （c）

為揭示納米藥物殺傷HepG2 細胞的作用機制，利用流式細胞術評價了納米藥物（ρB-HA/Cis=24 μg/mL，ρCis=2.6 μg/mL）處理HepG2 細胞48 h 后的凋亡/壞死情況，結果如圖7 所示。由圖7 可知，PBS 和B-HA 納米載體處理HepG2 細胞時，未受影響的細胞占比分別為85.5%和85.3%（圖7（a，b）），兩者幾乎無差別，進一步證實了B-HA 納米載體優異的細胞相容性。B-HA/Cis 納米藥物處理的細胞發生凋亡/壞死的比例為76.7%（圖7（c）），然而若在施用納米藥物前用ρ=1 mg/mL 的HA 預處理細胞以實現去靶向目的，則細胞凋亡/壞死比例降為63.3%（圖7（d）），這表明游離HA 可與納米藥物競爭性黏附HepG2 細胞，降低細胞對納米藥物的攝取，證實納米藥物對HepG2 細胞有主動靶向功能。另外，游離順鉑處理的細胞發生凋亡/壞死的比例為83.0%（圖7（e）），高于納米藥物處理的細胞，表明納米藥物殺傷HepG2 細胞的效果具有一定滯后性，與前述MTT 結果一致。

圖7 PBS（a）、納米載體（b）、透明質酸+納米藥物（c）、納米藥物（d）和游離順鉑（e）處理HepG2 細胞48 h 后的凋亡/壞死情況Fig. 7 Apoptosis/necrosis of HepG2 cells treated with PBS （a）, nanocarrier （b）, HA + nanodrug （c）, nanodrug （d） and free cisplatin （e） for 48 h

3 結 論

（1）將白蛋白的非溶劑化自組裝現象和新型順鉑-酰肼配位化學結合，制備了白蛋白/透明質酸納米載體，其裝載順鉑的載藥量和載藥效率分別為10.8%和90.0%。

（2）B-HA/Cis 的平均粒徑約為150 nm，形貌為近球形，并具有響應腫瘤細胞內微環境中的酸性和還原性釋放順鉑的特性。

（3）B-HA/Cis 納米藥物載體可主動靶向HepG2 細胞，其體外殺傷HepG2 細胞的效果與游離順鉑相當，并且納米載體具有良好的生物相容性。