等離子體輔助納米涂層的構建及其成骨性能

2022-03-12 05:55:44郭西萌金莉莉李春旺何宏燕劉昌勝

功能高分子學報 2022年1期

郭西萌，金莉莉，李春旺，何宏燕，劉昌勝

（華東理工大學材料科學與工程學院，材料生物學與動態(tài)化學前沿科學中心，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

前十字韌帶（ACL）撕裂是常見的運動損傷，其損傷可能導致膝關節(jié)不穩(wěn)定、半月板損傷、關節(jié)軟骨退變等疾病，嚴重影響患者的行動與生活質量[1]。目前臨床ACL 重建使用的材料包括自體移植物、異體移植物和人工合成材料等。采用同種異體移植需要經歷1 年以上的“韌帶化”過程，尤其是術后早期因植入物缺乏支撐而產生摩擦損傷肌腱會導致滑膜炎[2]。人工合成的聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）人工韌帶不僅可以避免供體部位的并發(fā)癥和異體韌帶所產生的排異反應，還有創(chuàng)傷小、術后恢復快等優(yōu)勢[3]。但仍存在骨愈合不良、骨組織接合處不穩(wěn)定等問題[4]。PET 的分子結構和高結晶度導致其親水性較差，生物活性和生物相容性也差強人意，在臨床應用中受到了限制[5,6]。

ACL 損傷發(fā)生后，為了促進腱骨交界處的組織愈合，研究者在表面處理活性修飾韌帶、增強其腱骨結合方面開展了大量工作。常用的方法是，利用等離子體處理、涂敷親水性材料等賦予材料親水特性[7,8]；引入外源性細胞因子或負載細胞因子的DNA 質粒，調控細胞的生物學響應，進而改善腱骨愈合效果[9]。其中引入外源性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）是目前最為有效的手段之一。研究表明rhBMP-2 只有負載在一定結構和親和性較好的載體上才能發(fā)揮其誘導成骨活性[10]。目前rhBMP-2 載體材料主要包括凝膠膠原海綿、多糖及其衍生物等[11,12]。纖連蛋白（Fn）是黏附性蛋白，作為細胞外基質的主要成分之一，對細胞的鋪展、黏附和增殖都有一定的促進作用，并可通過整合素介導的信號通路刺激細胞早期的成骨分化[13]。Fn 與rhBMP-2 可以通過特殊結合域相互連接[14]，促進間充質干細胞（MSC）發(fā)生成骨分化，并促進體內成骨再生[15,16]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）通過增加小鼠骨髓間充質干細胞（rBMSCs）成骨相關信使核糖核酸（mRNA）的表達來增強堿性磷酸酶的活性，并促進最終的礦化[17]。臨床上使用的rhBMP-2 劑量過高，易引起異位骨形成和炎癥等并發(fā)癥[18]。為了解決這些臨床應用中的問題，結合等離子體輔助技術，將rhBMP-2、EGCG、Fn 精準可控地引入人工韌帶表面，可實現低劑量引入、高骨誘導性生成，增強人工韌帶與腱周組織之間的骨性結合。

本文以PET 編織的人工韌帶為研究對象，首先通過氧等離子體技術在PET 表面引入羥基基團；然后采用靜電吸附法制備以EGCG 改性的PET 人工韌帶（E-PET），并用相同的方法得到EGCG 和Fn 共同改性的PET 人工韌帶（E-Fn-PET）。隨后，將rhBMP-2 通過冷凍干燥負載到E-Fn-PET 的表面，制得rhBMP-2 修飾的B/E-Fn-PET。本文通過一系列細胞水平的評價驗證了改性后PET 表面的生物相容性和誘導成骨活性，證實了B/E-Fn-PET 表面的良好生物相容性和高成骨活性。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

PET 人工韌帶：上海第六人民醫(yī)院提供；EGCG、Fn：美國Sigma 公司；rhBMP-2：標準品，上海瑞邦生物材料有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、鬼筆環(huán)肽（FITC-Phalloidin）、4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、噻唑藍（MTT）試劑：美國Gibco 公司；BMP-2 ELISA 試劑盒：上海欣博盛生物科技有限公司。

1.2 測試與表征

使用上海爾迪公司Femto A 型等離子表面處理儀，對材料進行表面羥基化處理；配有X 射線能譜分析的場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立集團公司S4800 型，將材料用導電膠固定在樣品臺上，真空狀態(tài)下對樣品噴金60 s，觀察樣品的表觀形貌和測量樣品表面元素組成；多功能酶標儀：美國Molecular Devices 公司SpectraMax M2 型，檢測rhBMP-2 在樣品表面的釋放速率及rBMSCs 的細胞活性；伸縮式測角儀：中國上海中晨公司JC2000D2 型，通過固著滴落接觸角法測定樣品的親水性，使用接觸角測量儀，將3 μL 超純水從針頭中推出，滴落在樣品表面，立即拍攝圖像，通過軟件對水滴圖像進行分析，測量出水滴與接觸面的角度；原子力顯微鏡（AFM）：美國VEECO 公司Multimode VIII 型，測量表面粗糙度并通過NanoScope 軟件對拍攝圖片進行3D 效果模擬，得到樣品表面的3D 形貌圖像并比較表面粗糙度；激光共聚焦顯微鏡：日本尼康公司，拍攝熒光染色后的細胞狀態(tài)；倒置顯微鏡：德國徠卡公司880 型，拍攝堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅染色。

1.3 B/E-Fn-PET 納米改性涂層的制備

將PET 樣品裁剪成1 cm×1 cm 的正方形，浸泡在w=75%的乙醇中，超聲清洗30 min 后用大量去離子水沖洗材料表面，置于60 ℃干燥箱中干燥備用。將樣品放入等離子體處理器腔體中，通入氧氣，在70 W 的功率下連續(xù)處理60 s。選用足夠量的溶液浸沒PET 樣品，通過靜電吸附將10 μmol/mL 的EGCG、5 μg/mL 的Fn蛋白負載到材料表面，其余溶液保持在?20 ℃?zhèn)溆谩＠昧姿猁}（PBS）緩沖液將rhBMP-2 稀釋至800 ng/mL，緩慢且均勻地滴加到E-Fn-PET 表面。將其于?20 ℃冷凍4 h 后，置于無菌凍干機中冷凍干燥48 h，得到B/E-Fn-PET 涂層（圖1）。

圖1 B/E-Fn-PET 納米涂層的制備Fig. 1 Preparation of the nano-coating B/E-Fn-PET

1.4 rhBMP-2 的固載及釋放

為了探究rhBMP-2 在不同材料表面的釋放情況，采用酶聯免疫反應（ELISA）測定蛋白釋放動力學曲線。根據ELISA 標準方法進行實驗，其中自制rhBMP-2 標準品質量濃度分別為0、250、500、1 000、2 000 pg/mL。其中底物替換為底物A、B （底物A：3-（4-羥基）苯丙酸粉末0.0452 6 g 溶于11.3 mL 三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液中；底物B：10 μL H2O2溶于11.3 mL Tris-HCl 緩沖液中）。經過37 ℃恒溫震蕩避光孵育30 min，通過終止液停止顯色反應。使用酶標儀測量450 nm 處的吸光度（OD），此數據與結合的靶蛋白濃度呈正相關。

1.5 細胞生物學性能研究

1.5.1 納米涂層表面的干細胞黏附取2～5 代對數生長期的rBMSCs[19]，經胰蛋白酶消化后添加2 mL 培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液，將滅菌后的材料置于24 孔板中，表面滴加10 μL 高濃度細胞懸液靜置15 min，添加1 mL 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后依次使用w=4%的多聚甲醛溶液固定細胞；使用w=0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）溶液提高細胞的通透性；使用w=2%的FITC-Phalloidin 溶液和w=5%的DAPI 溶液分別對細胞骨架和細胞核進行熒光染色。采用激光共聚焦顯微鏡拍攝，判斷細胞的黏附和鋪展情況。

1.5.2 rBMSCs 在納米涂層上的增殖采用MTT 法對樣品進行生物相容性檢測，判斷材料對細胞增殖情況的影響。按照GB/T 16 886.12—2005 提取浸提液并配制成條件培養(yǎng)基。將rBMSCs 以每孔2×103的密度接種于96 孔板上。將細胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL 的MTT 溶液和200 μL 的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1、3、7 d 后，小心吸去上清液，避免槍頭觸碰藍紫色沉淀物。每孔加200 μL DMSO 充分溶解，通過酶標儀檢測490 nm 波長處的OD 值。在一定的細胞數量范圍內，MTT 結晶量與細胞數目呈正相關，通過樣品與空白對照組的對比可以判斷出樣品的細胞毒性。

1.5.3 ALP 染色和茜素紅鈣沉積染色評價材料的成骨活性將2～5 代rBMSCs 以每孔2×104的密度接種于24 孔板上并用α-MEM 浸泡，按照國標GB/T 16886.12—2005 提取浸提液。用浸提液培養(yǎng)rBMSCs。培養(yǎng)7 d后移除培養(yǎng)基，清洗并固定細胞后使用堿性磷酸酶試劑盒對細胞進行染色，并用倒置顯微鏡進行觀察。茜素紅可以與細胞中的鈣離子以螯合方式形成深紅色沉淀，沉淀物即為鈣結節(jié)。rBMSCs 在材料表面培養(yǎng)21 d后，清洗、固定細胞并使用茜素紅染液染色30 min，棄去染色液，以PBS 緩沖液清洗2 次后，用倒置熒光顯微鏡拍攝，判斷材料的成骨活性表達差異。

2 結果與討論

2.1 表面形貌分析

圖2 為PET 的水接觸角變化情況。未處理PET 的水接觸角為123°，親水性極差。經過氧等離子處理后的PET，水滴落下的瞬間在PET 表面攤平，幾乎測量不出接觸角。由于引入了親水的羥基，使處理后樣品的親水性顯著提高，表明氧等離子體處理可以極大地改善PET 表面的親水性。負載Fn 和rhBMP-2 后的水接觸角為67°，在接入了蛋白類大分子后，PET 表面的潤濕性反而變差。推測該種情況是由于Fn 和rhBMP-2 均為疏水蛋白所致。

圖2 PET 氧等離子體處理（a）前（b）后和（c）B/Fn-PET 的水接觸角Fig. 2 Water contact angle of PET (a) before and (b) after treated by oxygen plasma and (c) B/Fn-PET

如圖3 所示，未處理的PET 表面光滑并無其他附著物，單根纖維的直徑約為25 μm。E-PET 和E-Fn-PET的表面與未處理的PET 表面相比，有更多微米級和納米級顆粒的附著。含rhBMP-2 的3 組（B/PET、B/E-PET和B/E-Fn-PET）表面的附著物最多，推測其為凍干后附著在纖維表面的rhBMP-2。

圖3 樣品的SEM 照片Fig. 3 SEM images of samples

圖4 比較了PET、E-Fn-PET 和B/E-Fn-PET 樣品的表面粗糙度。未處理的PET 表面較為平坦，纖維熔噴過程中產生了0.31 μm 以下的輕微凸起。E-Fn-PET 表面的凸起約為26 μm，證明EGCG 和Fn 蛋白已固載于PET 表面。B/E-Fn-PET 表面凸起約為42 μm，表面粗糙度的明顯增加證明rhBMP-2 已順利固載于PET 材料表面。

圖4 不同納米涂層表面的AFM 表觀形貌比較Fig. 4 Comparison of AFM surface morphologies on the different nano-coating surfaces

2.2 rhBMP-2 的釋放動力學

圖5 顯示了rhBMP-2 固載于PET 材料表面的釋放曲線。rhBMP-2 的釋放分為兩個階段，即前24 h 的突釋和此后的持續(xù)釋放。對于B/PET 上的rhBMP-2，大約有60.3%的rhBMP-2 在24 h 內從B/PET 表面累積釋放，而后釋放速率逐漸降低。B/EFn-PET 表面的rhBMP-2 在前24 h 的累積釋放量僅為33.7%，有效降低了rhBMP-2 的突釋速率。B/PET、B/E-PET、B/E-Fn-PET 的釋放曲線表明，rhBMP-2 在第14 d 的累積釋放量分別為90.6%、87.1%、63.7%。這些結果證實B/E-Fn-PET 減緩了rhBMP-2 的釋放速率，使其具有持續(xù)釋放特性。其原因是：在PET表面引入羥基基團增強了基底材料的吸附力，提高了材料表面的親水性；表面帶正電荷的EGCG 通過靜電吸附作用與帶負電的羥基基團作用包覆于樣品表面；EGCG 的鄰苯二酚基團對蛋白質的偶聯將Fn 蛋白固定在樣品表面，Fn 蛋白分子的每個亞基都具有與rhBMP-2 的高親和力結合位點，從而增強了與rhBMP-2分子的結合能力，降低了rhBMP-2 的使用劑量，減緩了其釋放速率。

圖5 rhBMP-2 的累積釋放曲線Fig. 5 Cumulative release curves of rhBMP-2

2.3 表面改性對細胞黏附增殖的影響

成骨細胞在材料表面的黏附和鋪展是影響后續(xù)細胞生長、繁殖和分化等一系列生物學行為的關鍵。圖6對比了rBMSCs 在不同PET 表面共培養(yǎng)24 h 后細胞的黏附鋪展情況。如圖6 所示，經過24 h 的培養(yǎng)rBMSCs 在各樣品表面均已鋪展開。由于PET 屬于生物惰性材料，表面光滑不易與細胞發(fā)生作用，在未處理的PET 表面接種的細胞黏附形態(tài)最差；E-Fn-PET 的表面細胞黏附效果優(yōu)于E-PET 的效果，其原因在于Fn 對細胞黏附和鋪展有促進作用。實驗結果證實Fn 蛋白和EGCG 分子存在協(xié)同作用，在兩者共同作用下促進了rBMSCs 在PET 表面的黏附和鋪展。

圖6 rBMSCs 在PET、E-PET 和E-Fn-PET 表面的形態(tài)Fig. 6 rBMSCs morphology on the surfaces of PET, E-PET, and E-Fn-PET

圖7 顯示了rBMSCs 在不同PET 表面的增殖情況。當t=1 d 時，各樣品的細胞增殖情況沒有明顯區(qū)別，表明處理后的PET 細胞毒性小，處理過程對細胞生存率的影響較小。當t=3 d 時，添加了rhBMP-2 的3 組樣品細胞增殖速率明顯提升，尤其是B/E-Fn-PET 表面培養(yǎng)的細胞增殖速率最高。當t=7 d 時，各樣品的增殖情況相較于對照組均有顯著提升。其中B/E-Fn-P 表面的細胞增殖速率明顯高于其他樣品，表明EGCG、Fn 和rhBMP-2 共同促進了rBMSCs 的增殖。綜上所述，載有rhBMP-2 的納米涂層通過叁者協(xié)同作用調控細胞的黏附和生長，進而促進rBMSCs 的增殖行為。

圖7 rBMSCs 在不同PET 表面上培養(yǎng)后的細胞增殖行為Fig. 7 Cell proliferation of rBMSCs after cultured on the surfaces of different PET

2.4 不同PET 表面的ALP 染色和茜素紅染色比較

圖8（a）顯示了rBMSCs 在不同PET 材料表面培養(yǎng)7 d 的ALP 染色情況，ALP 是早期成骨細胞分化的標志物，其活性升高表明細胞發(fā)生了成骨分化。含rhBMP-2 的3 組（B/PET、B/E-PET 和B/E-Fn-PET）呈現出顏色更深的紫色沉淀，證明rhBMP-2 促進了rBMSCs 的成骨分化。圖8（b）通過對ALP 染色的定量分析顯示，rBMSCs 在B/E-Fn-PET 上的ALP 活性明顯高于其他樣品，表明B/E-Fn-PET 顯著地提高了rBMSCs 細胞的成骨分化能力。本文中通過EGCG 和Fn 蛋白引入低劑量的rhBMP-2 活性因子，在使用800 ng/cm2的低劑量條件下仍有利于ALP 的表達，并促進rBMSCs 的成骨分化。

圖8 rBMSCs 在各PET 樣品中培養(yǎng)7 d 后的ALP 染色比較Fig. 8 ALP staining of rBMSCs on different PET surfaces cultured for 7 d

圖9（a）顯示了rBMSCs 在不同PET 材料表面培養(yǎng)21 d 的茜素紅染色情況。各培養(yǎng)物中均出現了明顯的鈣結節(jié)沉淀，其中添加了rhBMP-2（B/PET、B/E-PET、B/E-Fn-PET）樣品的礦化表達明顯高于不含rhBMP-2的樣品，深紅色礦化結節(jié)更多。圖9（b）為對鈣結節(jié)的定量分析，B/E-Fn-P 產生的鈣結節(jié)最多，表明EGCG 與Fn 的協(xié)同作用可以明顯促進rhBMP-2 的成骨誘導作用并加速礦化進程。