溫度響應型酰腙可逆共價鍵水凝膠的制備及性能

何 元， 羅媛媛， 劉 通， 張銀山， 郭贊如， 章家立

（1. 華東交通大學材料科學與工程學院，高分子材料與工程系，南昌 330013；2. 重慶市計量質量檢測研究院，重慶 401120）

智能水凝膠能夠隨著環境（如pH、溫度、光、電等）的微小變化而發生可逆體積相變、溶膠-凝膠相轉變或其他物理化學性質變化[1]，在組織工程[2]和藥物控釋[3]等領域具有廣闊的應用前景。動態共價鍵構建的智能水凝膠因其良好的熱力學穩定性而受到青睞[4]。動態共價鍵又稱為可逆共價鍵，在外界環境微調情況下可實現可逆變化[5]。酰肼和酮羰基或醛基在中性或弱酸性條件下形成的酰腙鍵是典型的動態共價鍵之一[6,7]。Wang 等[8]制備了基于動態共價酰腙鍵交聯的自愈合水凝膠，基于酰腙鍵的可逆性，該水凝膠具有溶膠-凝膠轉變性能。Deng 等[9]制備了一種基于醛基和酰肼動態共價酰腙鍵的自修復聚合物凝膠，它在一定的pH 條件下可進行溶膠-凝膠轉變。Smeet 等[10]設計了可注射酰腙鍵交聯水凝膠，由于其靈活且易于調節，該凝膠有望應用在生物材料領域。考慮到高活性的醛基能夠和蛋白質中的基團反應而具有毒性風險，本課題組利用酮羰基和酰肼反應，構建了一系列具有溶膠-凝膠可逆轉變以及自愈合性能的動態可逆共價鍵水凝膠[6,7,11]。Chang 等[12]基于動態共價酰腙鍵制備了具有可逆溫度響應性的自愈合水凝膠，該凝膠展現出對人體體溫的溫度響應性。An 等[13]制備了可調控的溫度響應性水凝膠，該水凝膠表現出基于可逆酰腙鍵的自愈合性能、溫和的堿降解性和生物相容性。目前利用酰腙鍵構建水凝膠的研究報道中，溫度對水凝膠的穩定性和自愈合性的影響鮮有報道，對響應溫度的調控也缺乏細致研究。

本文首先通過可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT）聚合制備了共聚物聚丙烯酰胺-co-聚雙丙酮丙烯酰胺-co-聚N-異丙基丙烯酰胺（PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM）；然后使該共聚物和己二酸己二酰肼（ADH）反應，得到了含可逆共價酰腙鍵水凝膠。可逆共價酰腙鍵可以通過pH 調控其溶膠-凝膠轉變，同時可以通過調節溫度調控水凝膠的穩定性和自愈合性能。此外，本文試探性地將水凝膠作為藥物載體，考察了水凝膠的藥物釋放行為。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

丙烯酰胺（AM）、偶氮二異丁腈（AIBN）、ADH、阿霉素（Dox）：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；雙丙酮丙烯酰胺（DAAM）、N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）：分析純，東京化成工業株式會社；其他試劑均為市售分析純。

1.2 測試與表征

核磁共振儀：瑞士布魯克公司AVANCE 300 型，將共聚物溶于D2O 中，在25 ℃下測試; 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀：美國熱電公司Nicolet 6 700 型，使用KBr 壓片法制樣，測試范圍4 000～500 cm?1；凝膠滲透色譜（GPC）儀：美國沃特世有限公司Waters 2 410 型，聚氧乙烯醚（PEO）為參比物，0.1 mol/L 的 NaNO3溶液為洗滌液；紫外-可見光譜儀：日本 Hitashi 公司，測定共聚物溶液透光率隨溫度的變化，共聚物溶液的質量濃度為10 mg/mL；流變儀：奧地利Anton Paar 公司MCR 302 型，采用變頻掃描模式，固定應變（ε）為 1%（凝膠處于線性黏彈區），頻率范圍為 0.628～100 s?1；掃描電鏡子顯微鏡（SEM）：日本JEOL 公司JSM-7500F 型，凝膠樣品經冷凍干燥后進行觀察。

1.3 共聚物PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM 的制備

首先按文獻報道的方法[14]制備相催化鏈轉移劑（CTA）。通過RAFT 聚合的方法制備PAM-co-PDAAMco-PNIPAM。按照表1 投料配比，在三口瓶中加入NIPAM、AM 和DAAM，以及25 mL 二甲基亞砜（DMSO），在攪拌下通入N2脫氣處理30 min，在N2的保護下，加入CTA 0.092 2 g（0.252 mmol）和AIBN 2.1 mg（0.013 mmol），繼續通入N2攪拌15 min，升溫至70 ℃反應24 h。反應完畢后將反應物逐滴滴加到大量靜置乙醚中過濾沉淀得到沉降物。室溫下將沉降物真空干燥24 h，即得到PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM。依據表1 中的投料比，將共聚物標記為P1、P2、P3、P4、P5。

1.4 共聚物的低臨界溶解溫度（LCST）測定

取0.05 g 共聚物溶解在5 mL 去離子水中，共聚物溶液質量濃度為10 mg/mL。利用紫外-可見光譜儀繪制共聚物溶液在500 nm 波長下透光率隨溫度的變化曲線，曲線中透過率下降50%所對應的溫度為共聚物的LCST[8]。

1.5 水凝膠的制備

將0.5 g 的共聚物溶解在4.5 mL 水中，并加入ADH（其用量為共聚物中DAAM 單元物質的量的0.5 倍），待ADH 溶解之后，用鹽酸（3 mol/L）或NaOH（3 mol/L）調節混合溶液的pH，即得到水凝膠。共聚物P1、P2、P3、P4、P5 制得的水凝膠分別記為HG1、HG2、HG3、HG4、HG5。

1.6 水凝膠的 pH 響應性

配制固含量（w（HG）=m（Copolymer）/m（Hydrogel））為10%的水凝膠。溶膠-凝膠轉變過程用3 mol/L 的鹽酸或3 mol/L 的NaOH 調節pH。

1.7 水凝膠溫度響應的體積相變

將固含量為10%的圓柱形（高為0.5 cm，直徑為1.0 cm）水凝膠，置于不同溫度下，記錄水凝膠的體積變化，計算其溫度響應后的體積收縮率（ΔV）。

1.8 水凝膠的自愈合性能

選用2 塊大小相同的三角形形狀的水凝膠，將其中一塊用誘惑紅染色。2 塊水凝膠分別切割成4 小塊，然后再將其緊密拼湊在一起。在設定溫度下放置6 h，觀察水凝膠的自愈合能力。

1.9 水凝膠的穩定性及藥物控釋行為

配制4 塊同等大小、固含量為10% 的水凝膠HG5，分別將其置于不同pH 和溫度的磷酸鹽緩沖（PBS）溶液中，每隔1 h 記錄其質量，繪制水凝膠質量隨時間變化的曲線。以固含量為10% 的水凝膠HG5 作為藥物載體，將5 mg Dox 溶于10 mL 的P5 共聚物溶液中，加入0.087 6 g 的ADH，調節混合溶液的pH=5，制備負載Dox 的水凝膠。然后將其浸泡在不同pH 和溫度的50 mL PBS 溶液中，測試在485 nm 處的紫外吸收，計算不同時刻的Dox 釋放量，繪制載藥水凝膠的Dox 累積釋放量隨時間變化曲線。

2 結果與討論

2.1 聚合物的結構及分子量表征

共聚物的FT-IR 分析如圖1（a）所示。3 288～3 438 cm?1處為共聚物中N?H 的伸縮振動吸收峰，1 711 cm?1處為DAAM 單元中酮羰基的特征吸收峰，1 653 cm?1處為共聚物中酰胺的羰基伸縮振動吸收峰，1 550 cm?1處為共聚物中N?H 的彎曲振動和C?N 的伸縮振動吸收峰[6,12]。該結果說明共聚物由AM、DAAM 與NIPAM 3種單體聚合而成。圖1（b）為共聚物的1H-NMR 譜圖，化學位移0.9～1.2 處為NIPAM 單元上?CH3的氫質子峰，0.9～1.2 處為DAAM 單元上?（CH3）2C?的氫質子峰，1.2～1.8 處為主鏈上?CH2?的氫質子峰，1.8～2.3 處為主鏈上?CH?和DAAM 單元上?CH3的氫質子峰，2.8～3.3 處為DAAM 單元上?CH2?的氫質子峰，3.7～4.0 處為NIPAM單元上?CH?的氫質子峰。基于1H-NMR譜圖上相應質子峰的積分面積（A），根據公式（nAM:nDAAM:nNIPAM=2(Ab,d?2Ac?Ag):Ac:2Ag，A為峰面積）可以計算出共聚物中AM、DAAM和NIPAM的物質的量之比，計算結果列于表1。

表1 共聚物的組成及參數Table 1 Composition and parameters of polymers

圖1 PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM 的（a）紅外譜圖和（b） 1H-NMR 譜圖Fig. 1 （a）FT-IR and （b）1H-NMR spectra of PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM

從表1 可見：產物各組份的比例與投料比有微小差別，這是單體位阻效應所導致的結果[15]。1H-NMR 和FT-IR 的分析結果說明成功地合成了不同組成的共聚物。

2.2 聚合物的LCST

圖2（a）為共聚物溶液透光率隨著溫度的變化曲線。共聚物P1、P2、P3、P4 與P5 的LCST 分別為25.1 、27.1、28.0、30.5、36.1 ℃，說明可通過調控AM 單元的量得到不同LCST 的共聚物。此外，P1、P2、P3、P4 的LCST 低于純PNIPAM 的LCST[16]，這是由于DAAM 單元的加入使共聚物的疏水性增強，繼而降低其LCST[17]。隨著共聚物中AM 單元的增加，其親水性增加，共聚物的LCST 隨之升高。此外，共聚物的LCST 隨PAM 單元的增加而增加（圖2（b）），說明該類共聚物能夠通過控制PAM 單元的量實現響應溫度的調控。

圖2 （a）共聚物溶液透光率隨溫度的變化曲線；（b）共聚物的LCST 隨AM 摩爾分數的變化Fig. 2 （a）Temperature dependence of optical transmittance for polymer aqueous solution; （b）LCST of polymers varied with the mole fraction of AM

2.3 水凝膠的形成及流變性能

圖3（a）為水凝膠的模量對頻率的動態流變關系，圖中儲能模量（G′）恒大于損耗模量（G″）。這是典型的水凝膠流變行為[6,11]，說明共聚物與ADH 形成了水凝膠。另外，HG1～HG5 水凝膠的模量基本相當，這是由于共聚物（P1～P5）中DAAM 單元的含量接近，形成的交聯點數量也接近。ADH 用量對水凝膠模量的影響如圖3（b）和圖3（c）所示，隨著酰肼與酮羰基的比例（r=n（Hydrazide）:n（Ketone））增加，水凝膠的模量增加。當ADH 的用量進一步增加，過量的ADH 反而會影響水凝膠的模量，使之下降。形成水凝膠的最佳比例是r=1。從圖3（d）可見，水凝膠的模量還隨著水凝膠固含量的增大而升高。

圖3 （a）水凝膠的模量對頻率動態流變曲線；（b）不同酰肼與酮羰基比水凝膠（w（HG5）=10%）的模量對頻率動態流變關系；（c）HG5（w（HG5）=10%）的儲能模量G′ 隨酰肼與酮羰基比例的變化；（d）HG5 的模量對頻率的動態流變關系Fig. 3 （a）Dynamic rheological curves of hydrogels modulus changing with frequency; （b）Dynamic rheology of HG5（w(HG5)=10%）prepared by different hydrazide/ketocarbonyl mole ratio with frequency change; （c） G' of HG5（w (HG5)=10%） varies with the mole ratio of hydrazide to ketocarbonyl group; （d）Dynamic rheology of HG5 modulus with frequency change

2.4 水凝膠的pH 響應性

如圖4（a）所示，當pH =5.0 時，共聚物與ADH 形成了水凝膠；當pH =2.0 時，水凝膠轉變為溶液。調節體系的pH，水凝膠出現可逆的溶膠-凝膠轉變，表明水凝膠具有pH 響應性。對溶膠-凝膠轉變過程進行的FT-IR 分析如圖4（b）所示，當pH =7.0 時，在1 720 cm?1處觀察到DAAM 單元上C=O 的吸收峰；當pH=5.0 時，1 720 cm?1處的C=O 峰消失，而在 1 665 cm?1處出現了一個新的C=N 吸收峰，表明酮羰基和酰肼鍵形成了酰腙鍵[5-11]。當pH=2.0 時，1 665 cm?1處C=N 鍵的吸收峰消失，而 1 720 cm?1處的C=O 吸收峰再次出現，說明酰腙鍵發生了斷裂。分析證明調節溶液的pH，可使酰腙鍵的形成和斷裂可逆進行，水凝膠具有溶膠-凝膠轉變性能。

2.5 水凝膠溫度響應的體積相變

如圖4（c）所示，水凝膠在20 ℃下為無色透明狀，而在40 ℃下為乳白色，且體積明顯收縮，表明水凝膠具有溫度響應性。這是由于當溫度低于水凝膠中共聚物的LCST 時，共聚物為親水性，水凝膠的3D 網絡結構可以容納大量水分。當溫度高于共聚物的LCST 時，共聚物分子鏈發生卷曲和塌陷，擠出部分水分，體積縮小[18]。水凝膠在上述兩種狀態下的SEM 照片如圖4（d）所示，在20 ℃時水凝膠具有疏松多孔的3D 網狀結構，而在40 ℃下轉變為密集的小孔網狀結構，說明水凝膠在40 ℃發生了體積收縮。圖4（e）為水凝膠的體積收縮率隨著溫度的變化，水凝膠的體積收縮溫度隨著共聚物中AM 單元的增加而逐漸升高，但水凝膠的體積收縮率反而減小。這是因為隨著AM 單元的逐漸增加，水凝膠的親水性增強，使其體積相變溫度升高，而水凝膠中共聚物鏈收縮能力減緩[18]。

圖4 （a）水凝膠的溶膠-凝膠轉變圖；（b）P5 和ADH 混合體系的FT-IR 譜圖；（c）水凝膠溫度響應后的體積變化照片；（d）HG5在20 ℃和40 ℃下的SEM 照片；（e）水凝膠的體積收縮率Fig. 4 （a）Sol-gel transition images of hydrogels；（b）FT-IR spectra of P5 mixed with ADH; （c）Images of hydrogel volume change in response to temperature; （d）SEM images of HG5 at 20 ℃ and 40 ℃; （e）Volume shrinkage rate of hydrogels

2.6 自愈合性能

如圖5（a）顯示，在20 ℃下水凝膠在放置6 h 后，染料分子在樣品間的切割表面發生了滲透，4 小塊水凝膠融合為一體，且可承受自身重力而不分裂，說明水凝膠發生了自愈合。這是因為在響應溫度以下，切口處的酰腙鍵之間發生了動態交換，使樣品重新交聯在一起。圖5（b） 顯示，水凝膠在溫度高于LCST 時不能發生自愈合。其原因是當溫度高于共聚物LCST 時，水凝膠中共聚物的分子鏈發生卷曲和坍塌[18]，并包埋酰腙鍵，導致切口處的酰腙鍵很難發生動態交換。低于LCST 下水凝膠的自愈合能力如圖5（c） 所示，水凝膠HG5 在小應變（ε=1%）時保持穩定，G′高于G″；當大應變（ε=1 500%）施加到水凝膠上時，其網絡結構被破壞，G′低于G″。去除大應變后，水凝膠又快速恢復到凝膠狀態，說明水凝膠在低于LCST 時具有較好的自愈合能力。水凝膠模量隨著測試時間增加略微增加，是由于水凝膠水分的蒸發導致固含量略微增加所致。

圖5 （a）低于LCST（20 ℃）和（b）高于LCST（40 ℃）的自愈合圖；（c）HG5 的動態模量變化Fig. 5 Self-healing images （a） below LCST（20 ℃） and （b） above LCST（40 ℃）; （c）Dynamic modulus changes of HG5

2.7 水凝膠的穩定性及藥物釋放能力

如圖6（a）所示，當pH=2 時，在25 ℃下水凝膠的質量隨著時間的增加而逐漸減小，且在12 h 內完全降解；而在38 ℃下水凝膠質量先減小然后趨于穩定，質量變化率約為80%。這是由于當pH=2 時，酰腙鍵發生斷裂，水凝膠逐漸轉變為溶膠，因此在25 ℃下的水凝膠被完全降解。在38 ℃下，水凝膠發生溫度響應，失去部分水分。雖然部分酰腙鍵斷裂，降解能夠使水凝膠質量變小，但溫度響應后共聚物鏈的塌陷包埋了部分酰腙鍵，避免了水凝膠被完全降解。當pH=7.4 時，酰腙鍵處于成鍵狀態。25 ℃下水凝膠吸水溶脹，質量先增加70%，然后減少直至最后完全降解。這是因為水凝膠吸水溶脹后交聯點很難維持其3D 網狀結構而發生了降解[6]。在38 ℃下，水凝膠的質量緩慢減小，8 h 后不再變化，質量變化率為45%。這主要是因為在38 ℃下水凝膠會發生溫度響應導致部分失水，但水凝膠外層發生相轉變后內層水分不易擴散出來，使凝膠維持穩定。研究表明升高溫度有利于提高水凝膠的穩定性。

圖6 （a）HG5 的質量變化率隨時間變化情況；（b）負載Dox 的HG5 的藥物釋放曲線Fig. 6 （a）Mass change ratio of HG5 with time ; （b）Dox release profiles of Dox-loaded HG5

水凝膠對模型藥物Dox 的釋放性能如圖6（b）所示。在pH=7.4 的環境下，Dox 在38 ℃的釋放速率比25 ℃下更快。雖然水凝膠在38 ℃表現出溫度響應性，微觀上呈致密網狀結構（圖4（d））；但是升高溫度可以增強Dox 分子的熱運動[13]，有利于藥物Dox 的擴散釋放。此外，在38 ℃下水凝膠表現出溫敏性，其體積收縮導致Dox 隨著凝膠中水分擠壓而被釋放，提高了釋放速率。在pH=2 的環境下，25 ℃時Dox 釋放很快，3 h 內完全釋放，這是由于其快速降解所致。但在38 ℃下，Dox 的釋放速率比25 ℃的釋放速率小，45 h 才釋放完全。這主要是因為在38 ℃下水凝膠會發生溫度響應，有利于穩定水凝膠，降低釋放速率。上述研究結果說明：在酸性環境下，升溫可以提高藥物Dox 的緩釋性能。

3 結 論

（1）采用RAFT 聚合制備了共聚物PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM，共聚物的單元組成比例和單體投料比接近，其分子量以及分子量分布可控。

（2）共聚物表現出溫敏性，且濁點隨著共聚物中AM 單元的增加而線性升高。

（3）當pH=5 時，共聚物與ADH 反應形成的水凝膠表現出pH-溫度雙重響應性，通過溫度調節可以控制水凝膠的穩定性和自愈合性。

（4）水凝膠能夠作為藥物載體，其藥物釋放受到pH 和溫度的影響。當pH=2 時，升高溫度有利于緩釋；當pH=7.4 時，升溫能夠加速藥物釋放。