膠體金免疫層析法快速檢測血培養腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的對比研究

劉澤世，呼 瑞，李 靖，殷 鑒，耿 燕，白 露

(1.西安交通大學第二附屬醫院檢驗科， 陜西 西安 710004； 2. 西北婦女兒童醫院重癥監護室， 陜西 西安 710061； 3. 空軍軍醫大學西京醫院檢驗科， 陜西 西安 710032)

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌(carbapenem-resistant enterobacterales,CRE)引起的感染與較高的發病率和病死率顯著相關，在CRE引起的血流感染中，病死率可高達53.1%[1-2]，患者疾病負擔重。一項流行病學調查發現，我國89% CRE產生碳青霉烯酶[3]，可用于治療產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌(carbapenemase-producing enterobacterales,CPE)的藥物極少，替加環素、黏菌素以及頭孢他啶/阿維巴坦是目前國內主要的治療藥物。而對不同類型的碳青霉烯酶，頭孢他啶/阿維巴坦體外抗菌活性作用不同：頭孢他啶/阿維巴坦對金屬酶無效，但對絲氨酸酶、AmpC酶以及ESBL酶敏感[4-5]。據報道，對于CRE血流感染的治療，初始抗菌藥物的治療對提高患者生存率有重大的臨床意義[6]，因此，快速檢測血流感染中產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌并進行碳青霉烯酶型的鑒定，對早期優化抗菌藥物治療和提高生存率是必不可少的。本研究旨在評估兩種商品化膠體金試劑對碳青霉烯耐藥腸桿菌目細菌五種主要碳青霉烯酶[klebsiella pneumoniae carbapenemase(KPC)、new delhi metallo-β-lactamase(NDM)、verona integron-encoded metallo-β-lactamase(VIM)、imipenemase metallo-β-lactamase(IMP)、oxacillinase48(OXA)-48]的檢測能力，以期為臨床CPE的診斷、治療以及感染控制提供參考數據。

1 資料與方法

1.1菌株來源 復蘇西安交通大學第二附屬醫院2019—2020年血培養標本陽性非重復CRE57株和碳青霉烯類敏感腸桿菌目(carbapenem-Sensitive Enterobacterales,CSE)22株，包括肺炎克雷伯菌41株，大腸埃希菌14株，陰溝腸桿菌12株，產酸克雷伯菌6株，弗氏檸檬酸桿菌3株，產氣腸桿菌3株。

1.2主要儀器與試劑 VITEK-Ⅱ-COMPACT鑒定儀(BioMérieux公司，法國)，血平板、麥康凱平板(安圖公司，鄭州)，NG-Test CARBA 5檢測試劑盒及陽性血培養物檢測樣品制備試劑盒(中生眾捷生物技術，長沙)，金山川碳青霉烯酶耐藥檢測試劑(金山川科技發展有限公司，北京)。

1.3菌株鑒定 復蘇57株血培養細菌，經VITEK-Ⅱ-COMPACT鑒定儀鑒定均為腸桿菌目細菌，且對碳青霉烯類藥物耐藥。

1.4NG-Test CARBA5 滴入5滴(約150 μL)提取緩沖液于無菌EP管中；1 μL接種環取一環細菌樣本置于含150 mL提取緩沖液的EP管中，使用渦旋振蕩器混合振蕩幾秒鐘使之混合均勻；一次性移液管吸取100 μL制備好的混合液，加入到檢測卡盒上標記了“S”的樣本孔，加樣后于室溫下放置15 min，在20 min內讀取結果。

1.5金山川碳青霉烯酶耐藥檢測 試劑盒與接種待測菌株血平板恢復至室溫后，于無菌EP管中滴加10滴樣本處理液，使用無菌接種環挑取適量菌株至EP管中，充分攪拌，使溶液混合混勻，用移液槍吸取50 μL稀釋后的樣本加至檢測卡的加樣孔處，10 min后讀取結果。

1.6統計學方法 以PCR測序結果為標準，計算NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測的敏感度、特異度。

2 結 果

2.1碳青霉烯酶基因的檢測對57株CRE和22株CSE采用PCR方法檢測碳青霉烯酶基因(blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like,blaIMP和blaVIM)。PCR所用引物與條件參考Poirel等的研究[7]。對PCR陽性擴增產物進行測序，并應用GenBank中Blast進行序列比對。結果顯示，57株CRE均檢出碳青霉烯酶基因，包括blaKPC(n=26)、blaNDM(n=21)、blaIMP(n=3)、blaKPC+NDM(n=3)、blaNDM +IMP(n=4)。22株CSE菌株未檢測到任何碳青霉烯酶基因。

2.2膠體金免疫層析法酶型檢測 57株CRE經NG-Test CARBA 5可檢測出酶型KPC(n=26)、NDM(n=21)、IMP(n=3)、KPC+NDM(n=3)和IMP+NDM(n=4)。經金山川碳青霉烯酶耐藥檢測可檢測出酶型KPC(n=27)、NDM(n=23)、IMP(n=3)、KPC+NDM(n=2)和IMP+NDM(n=2)。大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、產氣克雷伯菌和弗氏檸檬酸桿菌均產單一酶型，兩種檢測方法結果一致。肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌檢出單酶型和雙酶型，其中，單酶型菌株經NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測結果一致；雙酶型檢測時，NG-Test CARBA 5均可檢測出，而金山川碳青霉烯酶耐藥檢測在兩種酶型時，部分菌株可檢測到兩種酶型，部分菌株僅可檢測出一種酶型，存在漏檢KPC或IMP。兩種方法均未檢測出VIM和OXA-48-like酶型。22株CSE經兩種方法檢測均未檢出任何酶型。見表1。

表1 157株CRE和22株CSE經NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測酶型檢測結果Table 1 Isoenzyme test results of 57 CRE and 22CSE by NG-Test CARBA 5 and Jinshanchuan carbapenemase resistance test

3 討 論

碳青霉烯酶的快速檢測有助于預防和控制產碳青霉烯酶細菌所引起的院內傳播和感染。而快速鑒定碳青霉烯酶的類型有助于指導治療產碳青霉烯酶細菌的感染。據報道，blaKPC-2和blaNDM是我國碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌中最常見的碳青霉烯酶基因[8]。我國耐藥監測網監測數據顯示，CRE耐藥形勢嚴峻，肺炎克雷伯菌作為CRE中耐藥率上升最快的細菌，其對碳青霉烯類藥物(美羅培南)的耐藥率已由2005年的2.9%攀升至2020年的26.4%。中國一項CRE碳青霉烯酶分布調查顯示[9]，產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌高97.4%，在成人和兒童中分別流行KPC-2和NDM酶，對產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌快速、準確地檢測，有助于合理選擇抗菌藥物治療，減緩細菌產生耐藥性，預防和控制產酶菌株的傳播。此外，若能進一步快速準確的區分碳青霉烯酶類型，對指導產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌感染的治療具有重要意義。據報道，大多數產KPC-2或OXA-48樣碳青霉烯酶菌株對國內2019年新上市的酶抑制劑復合制劑頭孢他啶/阿維巴坦有抗菌活性，相反，產金屬酶(NDM、VIM、IMP)菌株對頭孢他啶/阿維巴坦不敏感，臨床需根據藥敏結果考慮使用其他抗菌藥物，如替加環素、黏菌素或氨曲南/阿維巴坦[10]。

目前臨床實驗室開展了諸如Carba NP試驗、改良碳青霉烯滅活試驗、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗等表型檢測方法檢測碳青霉烯酶。Carba NP試驗操作簡單，并可快速(4～6 h)得出陽性結果，檢測碳青霉烯酶的敏感度在73%～100%不等，適合所有臨床微生物實驗室開展，但此方法因某些特殊試劑有效期短，需自制，顏色判斷受主觀因素和培養基種類的影響，且對于某些類型碳青霉烯酶(如OXA-48，-23)檢測水平較低，不推薦作為常規檢測方法[11-13]。值得注意的是，雖然近年來上市了一些基于Carba NP試驗的商品化試劑，如Neo-Rapid Carb screen，Carb Blue screen和in-house Carba NP等，但依然未克服對OXA-48-like型碳青霉烯酶檢測敏感度低的弊端[14-15]。

改良碳青霉烯滅活試驗(modifified carbapenem inactivation methods,mCIM)檢測碳青霉烯酶敏感度為93%～100%、特異度為97%～100%，當mCIM和EDTA-CIM 檢測金屬碳青霉烯酶時，敏感度為89.3%，特異度為98.7%。聯合使用可判斷出腸桿菌目細菌產生碳青霉烯酶的種類，但此種方法的不足之處在于需過夜孵育，延長臨床周轉時間，若存在同時產絲氨酸酶和金屬β-內酰胺酶的菌株，eCIM會出現假陰性結果[16]。

同樣，碳青霉烯酶抑制劑增強試驗也需過夜孵育，其在檢測產單一酶型(KPC和金屬酶)時敏感度高(100%)，但檢測同時產KPC和金屬酶的菌株敏感度和特異度分別為96.8%和98.8%[17]，且無法檢測到OXA-48酶。在腸桿菌中用硼酸衍生物(boronic acid derivatives，BA)和吡啶二羧酸(dipicolinic acid，DPA)/乙二胺四乙酸進行的碳青霉烯酶抑制試驗。鑒定A、B和OXA-48類碳青霉烯酶的敏感性為95%、90%和100%，特異度為96%至100%[18]。

與表型檢測方法相比，免疫層析法能快速簡便地對臨床上分離菌株進行碳青霉烯酶檢測。有研究表明，NG-Test CARBA 5在血培養陽性標本中的敏感度和特異度分別在95.8%～97.7%和93.3%～96.1%之間[19-20]。NG-Test CARBA 5可以快速檢測五種碳青霉烯酶：KPC、OXA-48-like、IMP、NDM和VIM，金山川碳青霉烯酶耐藥檢測亦可五種主要碳青霉烯酶：KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48。NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測均是膠體金免疫層析法，一個測試盒即可完成對五種的酶型的測定，20 min內即可得到結果。對碳青霉烯類藥物耐藥腸桿菌目細菌已在全球蔓延，如何盡早檢出并針對不同酶型進行優化治療成為關鍵問題[21]。因此，檢測碳青霉烯酶基因(如blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、blaNDM和blaVIM)對于感染的控制和選擇合適的抗感染治療均至關重要。 盡早的檢出五種酶型，可以及時將頭孢他啶阿維巴坦與其他β-內酰胺/ β-內酰胺酶抑制劑聯合使用。五種酶型是腸桿菌目細菌常見的碳青霉烯酶型，可以區分絲氨酸β-內酰胺酶與金屬β-內酰胺酶，不僅有助于優化抗生素管理，改善預后，甚至可以預防出現進一步耐藥[22-23]。

本研究中，57株CRE分離株和22株CSE分離株經NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測。無論單一酶型或雙酶型時，NG-Test CARBA 5對KPC、NDM、IMP、KPC+NDM和NDM+IMP的檢測率均為100%，且與PCR結果一致，沒有假陽性。金山川碳青霉烯酶耐藥檢測可有效檢測單一酶型，且與NG-Test CARBA 5符合率可達100%。但當存在雙酶型時，金山川碳青霉烯酶耐藥檢測部分菌株可檢測出雙酶型，部分菌株只能檢測出其中一種酶型，存在漏檢IMP或KPC酶型，這可能與兩條帶表達的強度有關[24-25]。金山川碳青霉烯酶耐藥檢測沒有假陽性。

兩種膠體金方法操作簡單，能快速準確的區分碳青霉烯酶酶型，有助于簡化臨床上常規檢測碳青霉烯酶的工作流程，適用于臨床快速診斷碳青霉烯酶并進行酶型區分，為臨床提供確切的碳青霉烯酶型別，優化治療方案。而可能由于VIM流行率較低的原因，本次研究中并未檢測到VIM。NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐藥檢測無法區分OXA-48-like的變異體(OXA-48-、OXA-181-、OXA-163-、OXA-232-和OXA-405型碳青霉烯酶)，如果菌株存在上述變異體型碳青霉烯酶，則可能被認為未產OXA-48-like碳青霉烯酶，從而得到假陰性結果。這些檢測方法的檢測范圍有限，僅涵蓋了常見的碳青霉烯酶，可能會漏檢其他碳青霉烯酶，如GES、IMI和GIM等。本實驗中未檢測到VIM和OXA-48酶，其原因之一可能是因為VIM和OXA-48在我國流行率不高，二是標本量不充分，未能涵蓋到這兩種酶型，我們仍需收集產VIM和OXA-48酶菌株，以期對兩種膠體金方法檢測五種主要的碳青霉烯酶的性能進行更全面的評估。

總之，兩種試劑都為檢測所有常見碳青霉烯酶提供了一種新的方法，適合于大面積初篩以確定是否產碳青霉烯酶，兩種檢測方法結合使用可以更好的減少CRE的發生率，在控制感染暴發應用前景廣闊[26]。