慢性腎病血管鈣化的發病機制研究進展

聞 松，徐正宇(綜述)，蔡子怡，劉 巍(審校)

(1.河北醫科大學基礎醫學院臨床醫學2017級一大班，河北 石家莊 050017；2. 河北醫科大學基礎醫學院臨床醫學2017級四大班， 河北 石家莊 050017；3.河北醫科大學基礎醫學院病理學教研室，河北 石家莊 050017)

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)作為全球重要的公共衛生問題，受到了越來越多的關注。各國CKD患病率高達10%～12%，并且患病率隨著年齡的增長顯著增加[1]。隨著研究的深入，眾多證據表明，并發心血管疾病是CKD患者死亡的首要危險因素，而血管鈣化(vascular calcification，VC)是導致CKD患者并發心血管疾病的主要原因[2]。VC是血管非生理性的鈣鹽沉積過程，導致動脈彈性下降、收縮壓升高、心臟負荷増加，顯著提高了心腦血管事件的發病率和病死率。VC是一個主動的高度調控的過程。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨細胞表型分化并分泌細胞外囊泡作為磷酸鈣沉積位點在VC中起著至關重要的作用。隨著腎病的進展，出現了一系列調控VC的非傳統因素，包括鈣磷代謝紊亂、炎癥、氧化應激、細胞衰老、脂肪因子等[3]。

1 CKD血管鈣化的特點

VC通常被視為動脈粥樣硬化的晚期階段，CKD患者可觀察到動脈內膜和中膜鈣化，以中膜鈣化更為多見。血管中膜鈣化也可稱為Monckeberg動脈硬化，被認為是非炎性的過程，常發生在老年患者、糖尿病或CKD患者。中膜鈣化的特征是動脈壁中彈力層進行性硬化，可使血管彈性減弱、收縮壓升高、脈率加快和心室負荷增加，甚至心力衰竭而死亡[4]。以往的觀點認為，VC發生發展的主要原因是鈣、磷鹽在血管壁的被動沉積。而近些年的研究認為VC是一個類似于骨形成主動的、活躍的、可被調控的過程。VSMCs在CKD血管鈣化這一過程中居于核心地位。CKD發生發展中，VSMCs在炎癥、氧化應激、細胞衰老、自噬及鈣磷代謝紊亂等多種因素調控下，可由收縮表型向巨噬細胞、成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等多種表型轉變，進而發生凋亡并產生釋放凋亡小體和基質囊泡，成為羥基磷灰石晶體沉積的位點；并表達成骨相關蛋白，導致鈣調因子失衡，最終引起CKD血管鈣化。

2 CKD血管鈣化的發生機制

2.1血管平滑肌細胞向成骨細胞表型轉化 健康人體組織中，平滑肌具有收縮表型，可表達一系列收縮蛋白，如平滑肌-肌球蛋白重鏈SM-1和SM-2、α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)及鈣調理蛋白(calponin)等。同時，相比于心肌細胞，平滑肌細胞在一定條件下可轉分化為其他表型的細胞，具有表型的可塑性。在CKD、糖尿病、衰老、炎癥和各種毒素作用下，平滑肌細胞通過下調上述收縮蛋白并上調Osterix蛋白、相互作用蛋白Msx2(Msx2-interacting nuclear target protein，Msx2)、核心結合因子α1(core binding factor α1，Cbfα1)、SRY-Box 轉錄因子9(SRY-Box transcription factor 9，Sox9)和Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)等成骨相關轉錄因子從而去分化或轉分化為成骨細胞、軟骨細胞[5]，這些轉分化的平滑肌細胞可介導血管壁中礦物質的沉積。VSMCs表型轉化在CKD血管鈣化的發病機制中居于中心環節，有效逆轉或延緩VSMCs轉分化是減慢VC的關鍵。

2.2血管內皮間質化(endothelium-mesenchymal transformation，EndMT) EndMT已被揭示為人類多種疾病，包括癌癥和心血管疾病的常見原因。在VC中，血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)可以作為成骨前體細胞的額外來源。血管內皮細胞經歷EndMT的過程，涉及內皮功能喪失和成纖維細胞樣表型的獲得，最終形成具有成骨潛能的細胞。EndMT受不同的細胞外生長因子、炎性細胞因子、成纖維細胞生長因子和各種因素(機械應力、缺氧)的調節。骨髓間充質干細胞是與血管再生有關的祖細胞，而白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)是尿毒癥患者骨髓間充質干細胞鈣化表型轉化的關鍵誘因，通過下調BMPⅡ型受體(bone morphogenetic proteinreceptor 2，BMPR2)誘導人主動脈內皮細胞EndMT，單獨或聯合使用這些分子的靶點藥物可額外拮抗尿毒癥患者血清的促鈣化特性。Sánchez-Duffhues等[6]進一步研究指出BMPR2-JNK信號軸是調節炎癥誘導的EndMT并促進鈣化的關鍵途徑。即便諸多研究證實EndMT在CKD血管鈣化中發揮了重要作用，但具體機制仍不清楚，依然有待進一步的研究。

2.3細胞凋亡及基質囊泡的形成 在CKD各種因素刺激下，VSMCs向成骨樣細胞分化，同時VSMCs和成骨樣細胞發生凋亡，這將促進VC的發生發展。VSMCs和成骨樣細胞凋亡或壞死后降解并分泌的基質囊泡和凋亡小體可使鈣磷聚集并使其形成羥基磷灰石晶體。羥基磷灰石通過JNK/c-JUN通路誘導VSMCs凋亡以及成骨分化，進而促進血管鈣化的發生[7]。線粒體靶向抗氧化劑Mitoquinone通過通過激活Keap1/Nrf2通路，從而增強抗氧化能力，減少細胞凋亡，進而延緩CKD患者血管鈣化的進程[8]。Mitoquinone可能是一種有效的預防CKD患者VC的新療法。維生素K2通過Gas6/AxL/Akt降低VSMCs凋亡從而抑制鈣化；而高鈣或高磷的環境可誘導VSMCs質膜形成并釋放基質囊泡促進鈣化。同時基質囊泡具有很強的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。ALP不僅能破壞VC抑制劑無機焦磷酸鹽的結構和活性，并能導致血管內皮功能障礙[9]。此外，ALP與C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)相關，表明ALP與炎癥有關。

2.4鈣化調節因子失衡 在健康個體中，鈣化與抗鈣化系統處于平衡狀態，因此不易發生VC。眾多研究發現，在CKD患者中，骨鈣素(bone gla protein，BGP)、骨形態發生蛋白2(bone morphogentic protein-2，BMP-2)、脂質過氧化產物以及ALP等鈣化促進因子表達水平升高；而骨形態發生蛋白7(bone morphogentic protein-7，BMP-7)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、基質Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、胎球蛋白A(fetuin-A)以及焦磷酸鹽(pyrophosphate，PPi)等鈣化抑制因子功能喪失或表達水平下降。

BMP-2不僅能誘導Msx2和脂蛋白受體相關蛋白的表達促進血管鈣化，而且可促進VSMCs的成骨樣變;而BMP-7通過降低Cbfα-1的活性，抑制VSMCs表型分化，顯著抑制血管鈣化[10]。骨鈣素通過結合羥基磷灰石形成復合體，減少血管壁羥基磷灰石的沉積、增加巨噬細胞對復合體的吞噬和拮抗BMP-2從而抑制血管鈣化[11]。因此，鈣化與抗鈣化系統的失衡是導致VC發生發展的關鍵因素，其對VC的促進作用可能與包括氧化應激、細胞凋亡、炎癥、miRNA以及高血磷在內的多種因素相關，相關機制有待進一步研究。

2.5炎癥 CKD患者中普遍存在全身循環中炎癥介質低水平存在并持續升高的微炎癥狀態，IL、CRP、TNF-α以及TGF-β等炎性細胞因子參與CKD血管鈣化的調控。

以往研究表明，TGF-β1在鈣化的主動脈瓣中表達，并參與VSMCs的成骨樣轉化Beazley等[12]揭示了TGF-β-Wnt16-Notch信號通路在VSMCs的軟骨樣細胞轉化過程中的重要作用，Wnt16是Notch信號的正向調節因子，而TGF-β激活抑制了Wnt16的表達，進而促進VC的發生發展。盤狀結構域受體1(discoidin domain receptor-1，DDR-1)與TGF-β通路互相作用，抑制胞外囊泡釋放，進而抑制CKD血管鈣化進展。二氧化硫通過下調TGF-β/Smad途徑顯著改善VC。

在CKD患者中經常觀察到CRP升高，而高水平的CRP是與VC的危險因素。CRP能誘導VSMCs的炎癥反應，Liu等[13]對48例終末期腎病患者進行研究，發現高水平CRP患者橈動脈鈣沉積顯著增加，TNF-α和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)表達增加，并且揭示了炎癥通過激活mTORC1通路誘導VSMCs成骨樣分化，進而促進終末期腎病VC的進展。此外，CRP可介導氧化應激誘導平滑肌細胞的成骨/軟骨細胞樣分化，抗氧化劑可抑制CRP誘導的成骨/成軟骨信號和鈣化。

TNF-α可以通過核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/Msx2信號通路引起ALP表達增加和活性升高，促進平滑肌細胞的成骨樣分化，TNF-α抗體英夫利昔單抗可阻斷BMP-2-Msx2-Wnt3a/Wnt7a信號轉導通路，顯著抑制主動脈鈣蓄積。CKD患者的血液中的鈣蛋白顆粒(calcium protein particles，CPP)可以誘導TNF-α的表達和釋放，并通過其受體TNFR1促進鈣化；而siRNA可通過抑制內源性TNF-α/TNFR1的表達則可改善鈣化。Zickler等[14]對腎功能衰竭血液透析患者血清研究分析認為，尿毒癥患者血清中高水平TNF-α介導AP-1/c-fos信號通路誘導IL-6表達和分泌的顯著上調，進而促進VC。

Kurozumi等[15]研究提示，IL-6/STAT3/JMJD2B通路促進Runx2表達上調，導致平滑肌細胞向成骨樣細胞分化；使用IL-6受體拮抗劑，則可顯著抑制VC的發生發展。IL-8可通過阻斷骨橋蛋白的表達促進VC，而無機磷和吲哚硫酸酯等尿毒癥毒素會誘導內皮細胞IL-8的表達和分泌。IL-18通過激活ERK1/2/TRPM7信號通路促進β-甘油磷酸酯誘導的VSMCs成骨樣分化。IL-37水平與冠狀動脈鈣化嚴重程度平行，并且受炎癥以及OPG、高敏CRP等細胞因子的調節[16]。

綜上所述，慢性炎癥是慢性腎病VC的關鍵環節。在此過程中，各類免疫細胞被體內環境刺激活化并分泌細胞因子。這些細胞因子通過各種受體及信號通路介導VSMCs的成骨分化、凋亡及間充質轉化促進鈣化，因此抗炎是治療慢性腎病VC的關鍵。

2.6氧化應激 越來越多的研究表明，氧化應激在CKD血管鈣化的發生發展中發揮著重要作用[17]。多項研究證實狹窄或硬化VC沉積區活性氧(reactive oxygen species,ROS)、H2O2和NADPH氧化酶等表達增高。一些抗氧化劑，如槲皮素、二甲基延胡索酸和迷迭香酸等已被證明可以減輕VC。槲皮素可能通過調節氧化應激和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)/p38MAPK途徑對慢性腎衰竭大鼠的VC起到保護作用；二甲基延胡索酸和迷迭香酸通過Nrf2途徑，增強機體抗氧化能力，進而改善VC。

Byon等[18]研究揭示了PI3K/AKT/Runx2信號軸在調節H2O2誘導的VC中的關鍵作用。在VSMCs鈣化過程中，AKT信號激活介導了H2O2誘導的Runx2表達水平上調，進而促進VSMCs成骨樣化。若對AKT信號通路進行抑制，可觀察到Runx2表達下調和VC發生發展受到明顯抑制。Zhao等[19]研究提示氧化應激通過激活Src和BMK1誘導VSMCs凋亡。此外，一些研究表明NADPH氧化酶在CKD血管鈣化發生發展中也至關重要。相關研究認為，NADPH氧化酶活性增高可以促進鈣化促進因子，如OPN、BMP-2、BMP-4等表達增加[20]，使用抗氧化劑siRNA抑制NADPH氧化酶活性，可觀察到鈣化促進因子，如OPN、Cbfα1mRNA等表達明顯減少。Furmanik等[21]研究證實，Ca2+調控的NADPH氧化酶5(NADPH Oxidase 5，NOX5)水平升高導致氧化應激的發生發展以及基質囊泡的釋放，促進VC的發生發展。

2.7鈣磷代謝紊亂 通常CKD引起的鈣磷代謝紊亂在CKD晚期才會出現，主要表現為低血鈣和高血磷。CKD患者腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)降低，磷的排泄減少，導致高磷血癥，同時高磷會抑制1,25-(OH)2-D3的產生，加重低鈣血癥。CKD會伴有腎小管損傷，直接導致1α-羥化酶活性下降，從而導致1,25-(OH)2-D3水平下降，亦可加重低鈣血癥。研究表明，在GFR下降至60 mL/min時，甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)會大量分泌[22]。血鈣通過與甲狀旁腺細胞上的鈣敏受體(calcium-sensing receptor，CaSR)結合PTH的分泌進行調節。高磷血癥和低鈣血癥導致CKD患者甲狀旁腺主細胞增生和分泌旺盛，繼發甲狀旁腺功能亢進,這被認為是腎磷酸鹽排泄過少和1,25-(OH)2-D3缺乏的一種代償機制[23]。PTH可以下調組蛋白脫乙酰基酶Sirtuin1而誘導細胞凋亡，這提示PTH可能對血管鈣化有著直接作用[24]。

鈣磷代謝紊亂導致的高磷血癥在CKD患者VC中起到重要作用。磷酸鹽由鈉依賴型磷酸鹽(sodium dependent phosphate，NaPi)共轉運蛋白介導而進入細胞。高磷會激活Ⅲ型NaPi共轉運蛋白PiT-1，促使磷酸鹽進入VSMCs，促進VSMCs發生表型轉化[25]。血清磷酸鹽升高促進血管基質鈣化還與生長抑制特異基因6(growth arrest-specific gene 6)的表達下調有關，生長抑制特異基因6的抗凋亡作用通過Bcl2(B-cell lymphoma-2)介導PI3K/Akt途徑實現。高磷血癥通過增加線粒體ROS的產生促進氧化應激，上調Runx2的表達介導VC。同時，ROS的不斷增加介導了VSMCs的凋亡。此外，研究表明，高磷通過促進線粒體超氧陰離子產生引起VSMCs發生自噬;抑制自噬后，可以促進高磷誘導的基質小泡釋放，進而加速VC的發生發展[26]。表明高磷誘導VSMCs自噬通過拮抗VSMCs的鈣化是抑制VC的重要機制之一。因此，高磷血癥通過多條途徑介導CKD患者VSMCs的表型改變、凋亡、鈣化因子失調以及自噬等，促進血管鈣化的發生發展。

除了CKD患者高血磷和低血鈣帶來的一系列病理改變外，高血鈣也是促進動脈鈣化的因素，在CKD患者中高血鈣的發病病率為1.81%[27]，其與繼發性高PTH以及透析有關。高血鈣會促進VSMCs釋放基質囊泡，并且會加速VSMCs的凋亡。成纖維細胞生長因子23(fibroblast growth factor-23，FGF-23)主要作用是調節血磷水平，可激活腎臟的FGF-23-Klotho復合物，增加尿磷排泄[28]。在CKD患者中，FGF-23的水平隨著GFR的下降而升高，1,25-(OH)2-D3缺乏會導致FGF-23的過量表達。同時FGF-23還可降低1,25-(OH)2-D3，降低鈣和磷的重吸收，增加鈣和磷的排泄，這會進一步加重低鈣血癥。

迄今為止，許多研究報告了在CKD患者血清和尿液中的Klotho水平，但Klotho與CKD患者血管鈣化的關系存在爭議。有研究表明，Klotho可以作用于VSMCs，延緩CKD患者發生VC。在CKD早期即可出現血清FGF-23增加和Klotho減少，這對VC起到了正向作用[29]。亦有研究表明，Klotho與年齡相關，但與GFR、血清鈣水平或血清磷酸鹽水平無關，并且與FGF23相比，它與CKD的結果沒有強相關性[30]。同時，Buiten等[31]通過實驗指出，在CKD透析患者中，血清Klotho與心血管疾病和動脈鈣化沒有獨立關聯。這些研究結論表明Klotho能否作為CKD患者血管鈣化的一種標記物還需進一步的實驗和探索。

2.8脂肪因子 脂肪因子主要由脂肪組織產生，對糖脂代謝以及炎癥反應的調節發揮重要作用。越來越多的證據表明，網膜素、瘦素、脂聯素、內脂素、抵抗素、Apelin等眾多脂肪因子對VC起促進或抑制作用[32]。

瘦素和內脂素通過激活NF-κB引起的炎癥介質途徑加速VC。內脂素參與調節IL-6、細胞間黏附分子1和血管細胞黏附分子的表達[33]；瘦素介導OB-Rb/ERK1/2/RANKL-BMP4和OB-Rb/PI3K/Akt/RANKL-BMP4等通路促進VSMCs的成骨細胞分化，并上調了ALP、骨鈣素(osteocalcin,OC)、OPN、Runx2等的表達[34]。血清抵抗素水平與斑塊內中性粒細胞、巨噬細胞以及基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的含量呈負相關，也可通過抑制ERK2的磷酸化、消除CXC趨化因子配體8(CXC chemokine ligand 8,CXCL8)誘導的中性粒細胞遷移和肌動蛋白聚合減少中性粒細胞斑塊浸潤,從而促進VC[35]。

與之相反的是，脂聯素、網膜素1和Apelin作為抑制VC的脂肪因子，下調ALP的表達，并抑制β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate,β-GP)誘導的VSMCs中Runx2、BMP-2、膠原Ⅰ、骨鈣素和礦化基質的形成。脂聯素抑制STATS3磷酸化和核轉運來減少由β-GP誘導的VSMCs的成骨分化，下調成骨轉錄因子osterix的表達[36]。Apelin可以在體外通過ERK和PI3-K信號通路抑制VSMC的成骨細胞分化[37]。而網膜素-1通過PI3K/Akt依賴途徑抑制NF-κB受體活化因子配體，抑制Runx2和骨鈣素的表達以及基質礦化[38]。同時還通過抑制ERK/NF-κB通路，減少TNF-α激活的巨噬細胞中炎癥因子的產生，進而抑制血管內皮細胞的炎癥反應和凋亡,從而發揮抑制VSMCs增殖以及成骨樣分化的作用。

2.9微生物菌群 CKD患者的腸道微生物群顯著改變，導致細菌源性尿毒癥毒素產生增加,引起腸道上皮屏障破壞，促進毒素進入血液循環。通過對30例未接受透析的終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)患者進行研究，6例(20%)患者血液中檢測到細菌DNA。此外，血液中存在細菌DNA患者的CPR和IL-6水平顯著高于未檢出細菌DNA的患者。這些發現表明，生長過度的細菌從腸道轉移到血液中，促進炎癥，加劇了CKD的發生發展[39]。

腸-腎軸的提出也進一步揭示了腸道微生物菌群和CKD的關系。高蛋白高脂肪飲食引起的營養不良會導致甲苯基過量產生以及腸道甲酚和吲哚酚硫酸鹽累積，破壞腸屏障，增加腸壁通透性，內毒素和尿毒癥毒素通過血液循環流入腎臟導致腎臟炎癥。在免疫途徑中，來自骨髓的免疫細胞遇到營養不良的微生物群，在腸道內過度活化。腸道中產生的炎癥細胞、細胞因子和可溶性尿激酶纖溶酶原激活物表面受體(soluble urokinase plasminogen activator surface receptor,suPAR)通過血液循環促進腎臟炎癥[40]。目前有五種不同的腸源性尿毒癥毒素與CKD的心血管疾病相關：硫酸吲哚酚、吲哚-3-乙酸、對甲氧基硫酸、氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺。腸道炎癥和上皮屏障的破壞促進細菌全身易位，導致炎癥和白細胞刺激。硫酸吲哚酚和對甲苯基硫酸與3～4期CKD患者炎癥標志物水平升高相關，如IL-6和谷胱甘肽過氧化物酶，并且導致機體廣泛的氧化應激損傷。硫酸吲哚酚通過介導p44/42絲裂原激活的蛋白激酶途徑導致VSMCs增殖[41]，并與不對稱二甲基精氨酸共同加劇高血壓大鼠主動脈鈣化。在CKD患者中FGF-23與硫酸吲哚酚水平呈正相關，支持腸道源性尿毒癥毒素與CKD血管鈣化之間存在相關性[42]。

3 展 望

CKD并發心血管疾病的患者中普遍存在VC，而炎癥、氧化應激、鈣磷代謝紊亂、血管內皮間質化、脂肪因子、微生物菌群等因素在VSMCs所致CKD血管鈣化中發揮重要作用。根據鈣化機制所產生的不同靶點藥物，如Klotho、鋅劑、鎂劑、白藜蘆醇等為改善CKD患者血管鈣化提供更多的可能，而目前尚未有明確而有效的治療方式。因此，CKD血管鈣化的病理生理機制仍有待進一步的研究，以尋求更多的治療靶點，改善CKD患者的預后。