細胞外囊泡在肺部疾病診斷中的應用

楊晟楠，張 力(綜述)，石 瑜，趙 勇*(審校)

(1.天津市胸科醫院呼吸與危重癥醫學科，天津 300222；2.天津醫科大學總醫院呼吸與危重癥醫學科，天津 300052)

細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由細胞自然分泌的磷脂雙層膜包圍并且缺乏功能性核的結構，是多種亞型的集體術語，包括外泌體、微囊泡、微粒、凋亡小體和許多其他名稱[1]。外泌體是細胞膜內陷形成的多泡體(multivesicular body，MVB)與細胞膜融合后釋放到細胞外空間的膜性囊泡，直徑在40～150 nm[2]。微囊泡(microvesicles,MVs)大小不一，直徑在100～1 000 nm,從細胞膜出芽脫落[3]。這些納米大小的囊泡包含蛋白質，脂質，信使RNA(messenger RNA，mRNA)，微小RNA(microRNA)，非編碼RNA(lncRNA)和線粒體[4]。對于特定的細胞外囊泡，目前很難確定其具體的生物發生途徑，所以本篇綜述中將使用國際細胞外囊泡協會推薦的術語EV[5]。EVs由各種不同的細胞類型釋放，包括免疫細胞(巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞以及樹突狀細胞)和結構細胞(內皮細胞、肺泡巨噬細胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞)[6-7]。由于來源的多樣性，EVs可以在多種體液中檢測到，包括血液、尿液、唾液、母乳、羊水、胸腹水、精液、腦脊液和其他體液[3,8]。此外，在呼出氣和支氣管肺泡灌洗液中也發現了EV的存在[9-10]。EVs通過其攜帶的生物活性物質向受體細胞傳遞復雜的生物信息集從而調節其行為，是細胞間通訊的關鍵介質[11]。通過這種方式，EVs參與了多種肺部疾病的病理發展和進程，并且在疾病狀態下釋放的EVs數量、類型和攜帶物質是不同的，這表明EVs具有作為診斷和預后的新型生物標志物的潛力。

1 EVs的內容物

通過各種高通量測序分析平臺，可以深入了解了EVs攜帶的分子內容。由于這些技術需要大量的EVs，因此大多數分析研究都是基于細胞系分泌的EVs進行的。ExoCarta(www.exocarta.org)是一個專門用于編目EVs內容物的數據庫[12]，目前已確定了超過9 000種不同的蛋白質，3 408種mRNA，2 838種miRNA，1 116種脂質。與細胞RNA片段相比，EV轉運的RNAs通常較短(通常<200個核苷酸，但可以延伸至5 kb)。它們主要是非編碼RNA(ncRNA)，包括微小RNA(miRNA)、轉運RNA(tRNA)、以及長鏈非編碼RNA(lncRNA)和大部分片段化的mRNA[13]。非編碼RNA(ncRNA)不編碼蛋白質，而是在多種遺傳機制中起作用，例如調節RNA的結構，表達和穩定性，以及調節蛋白質的翻譯和功能。這些核酸分子存在于EVs中免受核糖核酸酶降解，使其成為強有力的循環生物標志物。近年來，EVs中的ncRNA已成為研究的新焦點。

2 EVs在肺部疾病診斷中的應用

2.1急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respira-tory distress syndrome，ARDS) ALI/ARDS是一種由肺內或肺外原因導致的復雜的臨床異質性綜合征。ALI/ARDS病理生理學特征為不受控制的肺泡炎癥反應，肺泡-毛細血管屏障功能嚴重受損，有效通氣肺組織減少及肺順應性下降[14]。目前能夠達成共識的有效治療策略僅限于保護性肺通氣，而藥物治療并沒有明顯降低ARDS的病死率(ARDS的病死率介于34.9%～46.1%之間)[15]。所以當前迫切需要鑒定出一種或幾種生物標志物用來監測疾病的活動狀態，以便指導臨床治療。Letsiou等[16]研究表明，在ALI的小鼠模型中，內皮細胞來源的微囊泡水平升高。蛋白組學分析顯示，血漿和支氣管肺泡灌洗液中CD62E陽性的微囊泡較對照組升高。這些內皮細胞微囊泡可能作為ALI的診斷型生物標志物。另一項臨床前研究表明，在鹽酸誘導的ALI小鼠模型的支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中，可以檢測到大量上皮細胞來源的微囊泡。通過q-PCR技術證實在這些微囊泡中miR-17和miR-221水平升高。miR-17/miR-221促進了β1整合蛋白的再循環并通過RAB11介導的途徑來促進巨噬細胞募集，最終導致肺部損傷[17]。在高濃度氧誘導的ALI小鼠模型的BALF中，同樣可以檢測到大量上皮細胞來源的微囊泡，通過q-PCR技術證實在這些微囊泡中miR-320a和miR-221水平升高[18]。故BALF中上皮細胞來源的微囊泡miRNA可以作為ALI早期診斷的潛在生物標志物。在臨床方面，一項前瞻性隊列研究表明，危重患者血漿中微囊泡水平的升高與ARDS風險的降低獨立相關[19]。在另一項臨床研究中，共納入158例ARDS患者，結果顯示患者肺泡間隙中存在大量外泌體，BALF中外泌體的水平與患者的氧合指數呈負相關，感染性病因引起ARDS的外泌體水平高于非感染性ARDS患者。但是ARDS患者中外泌體增加的原因尚不清楚，目前尚無法區分是與治療相關的高氧或本身缺氧所致，并且需要進一步的研究來鑒定外泌體的組成[20]。

2.2特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) IPF是一種慢性進行性間質性肺疾病，其肺組織學和胸部高分辨率CT特征表現為普通型間質性肺炎[21]。IPF病因尚不明確，發病機制也未完全闡明，目前認為肺泡上皮細胞損傷和異常修復是導致肺纖維化的主要機制[22]。該病預后差，在65歲以上患者中，確診后的平均生存期僅為3.8年[23]。由于發病原因和發病機制不明，目前的治療手段以減輕癥狀、改善患者病情為主，并且在疾病的早期診斷，評估病情進展及判斷預后等方面，缺乏有價值的生物標志物。Martin-Medina等[24]研究發現，IPF患者支氣管肺泡灌洗液中EVs較非IPF的間質性肺病以及非間質性肺病患者明顯增加,增加的EV在IPF中充當信號傳導介質(如WNT5A)的載體，促進了疾病的發生發展。Makiguchi等[25]通過microRNA PCR陣列的方法檢測博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型發現，血清EV中miR-21-5p在急性炎癥期和慢性纖維化期均升高。在同步進行的臨床研究中發現IPF患者的血清EV miR-21-5p明顯高于健康對照組。該研究還發現，血清EV miR-21-5p水平與6個月肺活量下降速率相關，并且與隨后30個月的病死率獨立相關。這些結果表明miR-21-5p有可能成為IPF早期診斷及用來判斷預后的生物標志物。另外，Njock等[26]研究發現IPF患者與健康對照組相比，痰液中外泌體miRNA含量存在差異，并確定miR-142-3P、miR-33a-5p和Let-7d-5p具有臨床意義。這其中miR-142-3P與肺彌散功能呈負相關，從而為IPF的診斷和病情評估提供了新的候選生物標志物。目前關于外泌體在IPF中的研究還非常有限，需要更多的研究來鑒定出用于早期診斷和評價預后的生物標志物。

2.3肺癌 肺癌是世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤[27]。由于缺乏有效的早期診斷方法，絕大多數患者在確診時已處于晚期，5年存活率僅為16%～18%[28]。因此需要尋找一種安全易行且準確率高的檢測方法來進行早期診斷。近年來，液體活檢由于其侵襲性最小、試劑消耗低和易于使用，已被廣泛研究并日益流行[29]，彌補了組織活檢的不足，成為精準醫學的診斷技術之一[30]。一項回顧性分析表明，血漿外泌體蛋白質組學分析顯示，與良性肺結節組相比，惡性肺結節組的纖維蛋白原β鏈(fibrinogen beta chain,FGB)和纖維蛋白原γ鏈(fibrinogen gamma chain,FGG)的表達明顯升高，并且FGB結合FGG檢測確定肺結節性質的靈敏度優于單FGB或FGG檢測，上述結果表明FGB和FGG可成為新型的生物標志物用來區分良、惡性肺結節[31]。Zhang等[32]比較了健康受試者和非小細胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)患者的血清外泌體lncRNA水平，發現外泌體lncRNA MALAT-1在NSCLC患者中高表達，并且MALAT-1的水平與腫瘤的分期及預后呈正相關。該研究進一步通過流式細胞技術檢測肺癌細胞Annexin/V的表達，證實了lncRNA MALAT-1可以防止腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的生長和轉移。該研究結果表明，外泌體中的lncRNA MALAT-1可以作為一種非侵襲性的基于血清的腫瘤生物標志物用于NSCLC的診斷和預后。Jin等[33]比較了I期NSCLC患者和健康對照者的血漿外泌體miR譜，發現miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p在腺癌中特異性表達，而miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b在鱗狀細胞癌中特異性表達，這表明腫瘤細胞分泌的外泌體miR可以作為肺癌早期診斷的生物標志物。在另一項臨床研究中發現，與健康對照組相比，在NSCLC患者的血漿外泌體中有6種差異表達的miR，分別為：miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19b-1-5p、miR-20a-5p、miR-92a-1-5p。將這6種差異表達的miR與三種腫瘤標志物(癌胚抗原CEA、細胞角蛋白19片段CYFRA21-1、鱗狀細胞癌抗原SCCA)在兩個獨立的隊列(訓練集：100例NSCLC和90例健康對照者；驗證集：72例NSCLC和47例健康對照者)中進行進一步驗證，結果表明miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1、SCCA組成的體外診斷小組，在訓練集中ROC曲線下面積為0.860，95%CI：0.802～0.906，敏感度63.0%，特異度93.3%；在驗證集中ROC曲線下面積為0.844，95%CI：0.766～0.904，敏感性76.4%，特異性76.6%。這表明miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1、SCCA組成的診斷小組對NSCLC的診斷具有重要的臨床意義[34]。

2.4肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH) PAH是由肺小動脈原發病變或其他原發疾病導致的肺動脈壓力升高，以肺動脈重構和肺血管阻力升高為特征，最終可導致右心功能衰竭甚至死亡[35]。PAH診斷的金標準是右心導管檢查，這項侵襲性檢查對患者來說具有很大的風險，所以研究人員一直致力于尋找循環中易于獲取的生物標志物。雖然心房鈉尿肽(BNP或NT-pro BNP)作為評價心室病理生理學變化的指標被廣泛應用，但是直到后期損傷發生之前該標志物的變化并不明顯。因此需要借助新的生物標志物進行疾病的早期診斷。在一項早期研究中，Amabile等[36]發現PAH患者外周血中外泌體含量明顯高于健康對照組。在隨后進行的另一項臨床研究中，將慢性血栓栓塞性PAH患者與健康對照組相比較，同樣發現血漿中外泌體的水平明顯升高[37]。但仍需進一步研究以明確這些外泌體中特征性表達的蛋白或核酸。最近的一項研究表明，翻譯控制的腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一種促增殖和抗凋亡的調節因子，在PAH大鼠模型的肺和血漿外泌體中TCTP明顯升高。與動物實驗結果一致，與健康對照組相比，特發性PAH患者BOECs(blood outgrowth endothelial cells)釋放的外泌體中腫瘤蛋白明顯升高，該研究提示外泌體中的TCTP有可能成為PAH的潛在診斷性生物標志物[38]。在評價疾病進展和判斷預后等方面，Lipps等[39]研究顯示，將慢性血栓栓塞性肺動脈高壓患者與健康對照組比較，通過下一代測序和q-PCR技術來檢測血清外泌體中小分子非編碼RNA(sncRNA)的差異表達，共鑒定出10種miR和21種piRNA。通過進一步生信分析證實，piRNA DQ593039的表達水平與平均肺動脈壓、肺血管阻力、右心室收縮壓和NT-pro BNP具有相關性。因此外泌體衍生的piRNA DQ593039可以作為評價PAH病情進展和判斷預后的潛在生物標志物。

2.5肺結核 據世衛組織報道結核病已經超過艾滋病成為全球范圍內發病率最高的傳染病[40]，造成這種局面的主要原因在于難以對結核病患者進行早期診斷，這也使得尋找結核病相關的診斷標志物顯得尤為重要。Lyu等[41]研究顯示，與健康者相比，結核病患者存在差異表達的血清外泌體miR譜，并且其中一些miR被進一步證實可以在潛伏性結核病感染(latent TB infection,LTBI)中特異性表達，為結核病的早期診斷提供了新的視角。另一項臨床研究顯示，結核病患者血清外泌體中miR-484、miR-425和miR-96的表達明顯升高，并與結核感染程度相關，證實了外泌體中的miR可以作為評價病情的潛在指標[42]。Wang等[43]報告了三種EVs攜帶的miRNAs，包括miR-148a-3p、miR-451a和miR-150-5p在結核病胸腔積液和良性病變胸腔積液間的差異表達。全球結核病的疫情急需快速簡便、高敏感性和特異性的新診斷方法，因此將EVs應用于診斷生物標志物的開發是有希望的。

2.6其他 結節病是一種多系統疾病，在表現和預后方面存在異質性。Martinez-Bravo等[44]利用質譜技術對結節病患者BALF中EVs進行了蛋白組學分析，鑒定出690多種蛋白質，包括幾種上調的炎癥相關蛋白質，為疾病診斷提供了新穎的方法。另一項獨立的研究表明，結節病患者的BALF中的EV數量增加，并且差異表達miR-146a和miR-150，其表達與肺功能指數呈負相關[45]。

3 小結與展望

EVs作為細胞間傳遞信息的載體，其在呼吸系統疾病中的應用已有初步研究。作為納米級的生物膜結構，EVs能夠很好的保護內容物的完整性和生物活性，這些優勢極大的提升了EVs在呼吸系統疾病診斷方面應用的可行性。隨著精準醫學概念的提出，越來越多的人開始關注如何做到疾病的精確診斷和治療。循環EVs的數量和類型根據肺部疾病的狀態而變化，EVs攜帶的物質，如miRNA、lncRNA等也會隨疾病狀態而改變，其有望成為肺部疾病的診斷性生物標志物。EVs中含有多種生物活性物質，目前研究多集中于非編碼RNA，對于EVs的蛋白組學和脂類研究較少，這些內含物對機體的作用有待進一步研究證實。未來還需進一步優化EVs的分離和純化技術，以便為后續的鑒定和功能研究提供良好的基礎。