山東省青島市貓病毒性鼻氣管炎流行情況調查

孫厚民，李陸梅，祝洪偉，陳玉霞，孫 鵬，楚電峰，范根成

（青島易邦生物工程有限公司，動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東青島 266100）

貓病毒性鼻氣管炎（feline viral rhinotracheitis，FVR）是由貓皰疹病毒Ⅰ型（feline herpesvirus-1，FHV-1）引起貓的一種急性、高度接觸性上呼吸道疾病，以打噴嚏、流淚以及結膜炎和鼻炎為主要臨床特征[1]，主要侵害幼貓，引起的發病率達100%，死亡率約為50%，對成年貓的病死率達20%～30%，是目前已知的重要貓呼吸道疾病之一[2]。FHV-1 是皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科水痘病毒屬成員，具有皰疹病毒的一般特性，病毒粒子直徑為126～167 nm，病毒粒子中心致密，外有囊膜，為雙股DNA 病毒，基因組大小為126～134 kb，立體對稱的核衣殼上分布有162 個殼粒[3]。FHV-1 于1958 年首次在美國被分離到[4]，現在世界范圍內廣泛流行[5-10]。為了解山東省青島市FVR 的流行情況，開展了FHV-1 感染情況篩查，并對篩查結果進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本信息 218 份貓拭子樣本編號為1～218號，來源于青島市市區及所轄的膠州市、平度市和萊西市，其中1～80 號在寵物貓主人家里采集，81～154 號采集于寵物醫院，155～194 號采集于寵物市場，195～218 號采集于寵物救助站；60 份貓血清樣本編號為1～60 號，其中1～40 號來源于寵物醫院，41～60 號來源于寵物救助站。

1.1.2 主要試劑及儀器 FHV-1 毒株和貓腎傳代細胞（F81），由動物基因工程疫苗國家重點實驗室提供；DMEM 培養基和胰酶，均購自Hyclone公司；DNA 快速提取試劑盒，購自杭州博日科技股份有限公司；離心機，購自德國Sigma 公司；PremixTaq及2 000 bp DNA Marker，均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；PCR 儀，購自德國Biometra 公司；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀，購自北京市六一儀器廠；凝膠成像分析儀，購自美國Bio-RAD 公司；倒置生物顯微鏡，購自徠卡顯微系統（上海）有限公司；CO2培養箱，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與處理

1.2.1.1 拭子樣本 用無菌棉拭子采集被檢貓眼鼻拭子，將拭子懸浮于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，漩渦振蕩1 min，除菌過濾后，取200 μL 按DNA提取試劑盒說明書提取DNA，將處理后的DNA樣品直接使用或于-70 ℃冰箱中保存備用。

1.2.1.2 血清樣本 前肢靜脈采血1～2 mL，37 ℃放置1 h，4 ℃放置30 min 凝固后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清直接使用或于-40 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 拭子樣本檢測

1.2.2.1 基因擴增 利用針對FHV-1gD基因建立的PCR 方法，對樣本進行基因序列檢測。檢測用上游引物FHV（gD）-F：atgatgacacgtctacattt；下游引物FHV（gD）-R：ttaaggatggtgagttgtat。擴增片段大小為1 125 bp。反應體系組成（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，提取的DNA 樣本2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，35 個循環；72 ℃最終延伸5 min。

1.2.2.2 PCR 產物檢測 取10 μL 擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE，130 V 電泳25 min，在凝膠成像分析儀下觀察PCR 產物條帶在凝膠中的位置，以2 000 bp DNA Marker 為參照物，判定結果。將PCR 陽性擴增片段進行測序，然后與GenBank中FHV-1 序列進行比對[11]。

1.2.2.3 陽性樣本復測 將所有PCR 檢測為陽性的樣本進行復測，復測仍為陽性的樣本判為陽性。

1.2.3 TCID50測定 將FHV-1 病毒液用含2%FBS 的DMEM 進行10 倍倍比稀釋，共稀釋12 個梯度，取長滿單層F81 細胞的96 孔細胞培養板，倒出生長液，將稀釋好的病毒液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每個稀釋度重復5 個孔；輕微搖動混勻后于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每日顯微鏡下進行細胞病變（CPE）觀察，連續觀察5 d；出現CPE 的孔記為“+”，未出現的記為“-”，按照Reed-Muench 法[12]計算該病毒懸液的TCID50。

1.2.4 血清樣品中和抗體效價測定 根據測定的TCID50值，將FHV-1 病毒液稀釋成2 00 個TCID50/0.1 mL；將待測血清樣品56 ℃滅活30 min，然后用含2% FBS 的DMEM 作2 倍倍比稀釋至1:1 024；吸取各稀釋度血清500 μL 加入到1.5 mL 離心管中，同時加入500 μL 已稀釋好的FHV-1 病毒液，輕輕搖晃混合后于37 ℃孵育1 h；取長滿單層F81 細胞的96 孔細胞培養板，倒出生長液，將血清病毒混合液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每個稀釋度重復5 個孔，同時設置陰性血清對照、病毒對照和正常細胞對照；于37 ℃、5%CO2培養箱中培養3 d，顯微鏡下觀察CPE。按照Reed-Muench法，計算待測血清樣品的中和抗體效價。

1.2.5 檢測結果分析 統計所有被調查貓的病毒攜帶率，對不同來源、年齡和性別貓的檢測結果，采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析，比較組間差異，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義；以中和抗體效價大于1:8 為陽性，等于1:8為可疑，小于1:8 為陰性[13]，統計不同來源血清樣本的抗體陽性率。

2 結果

2.1 PCR 檢測 電泳結果（圖1）顯示，218 份貓樣本中有22 份樣本擴增到約1 125 bp 的陽性目的條帶，對該22 份樣品進行復檢，仍均為FHV-1陽性，陽性率為10.1%（22/218）。

2.2 不同來源貓樣品檢測結果統計

22 份FHV-1 陽性樣品中，來自寵物救助站的4 份，陽性率為16.7%，檢出率最高，來自寵物貓主人家的6 份，檢出率為7.5%，但各組間均無顯著性差異（P＞0.05）。具體結果見表1。

表1 不同來源樣品的FHV-1 檢測結果

2.3 不同年齡和性別貓樣品檢測結果統計

從年齡來看，2～6 月齡幼貓的FHV-1 陽性率為13.6%，略高于成年貓（7.0%），但兩組間無顯著性差異（P＞0.05）；從性別來看，成年公貓陽性率（7.3%）稍高于成年母貓（6.7%），兩者亦無顯著性差異（P＞0.05）。詳見表2。

表2 不同性別和年齡貓的FHV-1 檢測結果

2.4 血清樣品抗體檢測結果統計 按照1.2.3 的方法計算出病毒懸液的TCID50為10-6.5/0.1 mL。在40份寵物醫院提供的血清樣本中，檢出陽性26 份，檢出率為65.0%（26/40）。20 份寵物救助站提供的血清樣本中，檢出陽性14 份，檢出率為70.0%（14/20）。血清中和抗體效價檢測詳見表3～4。

表3 寵物醫院40 份血清中和抗體檢測結果

表4 寵物救助站20 份血清中和抗體檢測結果

3 討論

Gourkow 等[14]在2013 年對加拿大西部一家動物收容所的250 只患有上呼吸道感染的流浪貓進行了FHV-1 qPCR 檢測，發現不高于3%的貓感染了FHV-1。2017 年Fernandez 等[15]對從西班牙多家動物醫院收集的358 只出現結膜炎和上呼吸道疾病的家養貓眼鼻口拭子進行了qPCR 檢測，結果FHV-1 陽性檢出率為15.1%。Nguyen 等[16]2019 年對從澳大利亞多家動物醫院收集的3 142 只出現上呼吸道疾病的家貓進行了PCR 檢測，結果FHV-1陽性檢出率為7%。FHV-1 呈間歇性排毒，多數情況下潛伏在三叉神經節，因此PCR 檢測結果與感染時間及排毒情況有關，呈一過性。本調查結果顯示，青島市FHV-1 的PCR 檢測陽性率為10.1%，寵物救助站貓的陽性率（16.7%）略高于其他來源貓，可能與來源復雜有關。2～6 月齡幼貓的FHV-1陽性檢出率較高，可能因其斷奶后失去母源抗體保護，而自身免疫系統尚未發育健全，所以應加強對斷奶后幼貓的相關免疫。

2012 年Digangi 等[17]對進入佛羅里達動物收容所的貓，針對FHV-1 的血清抗體滴度進行了流行率調查，結果發現347 只貓的血清陽性率為11.0%。2019 年Paola 等[18]對意大利米蘭流浪貓中抗皰疹病毒的血清抗體滴度進行了流行率調查，結果發現該地區流浪貓中抗皰疹病毒的血清陽性率為37.1%。本研究采用的中和抗體檢測方法，是抗體檢測的經典方法，也是“金標準”方法，既能定性也能準確定量。檢測結果顯示，寵物醫院接診貓的FHV-1 中和抗體陽性率為65.0%，雖然部分貓的抗體效價達到1:512，但抗體整齊度很差，且有35.0%貓的抗體滴度達不到最低保護標準，存在感染發病風險。跟蹤調查這40 份寵物醫院接診貓的免疫背景，有32 只貓免疫過FHV-1 疫苗，但有12只抗體呈陰性，表明抗體保護水平不高，因此應加強對寵物貓的免疫。寵物貓免疫FHV-1 疫苗后，有必要進行中和抗體效價測定，中和抗體效價不合格的需要補免。救助站收容貓的FHV-1 中和抗體陽性率高達70%，但抗體效價均較低，僅能達到1:16，有些可能是臨床發病康復后產生的抗體，然而救助站收容貓的抗原、抗體陽性率均較高，說明救助站收容貓的FHV-1 感染率很高，所以應加強對救助站收容貓的相關免疫。

本研究的采樣范圍和樣本數量有限，調查樣本基本來自寵物醫院、寵物救助站、寵物貓主人家和寵物市場，缺乏城市流浪貓、郊區野貓和林區山貓等不同背景的數據，這些問題有待于在更長時間段、更大范圍的數據收集基礎上進行探討，以便得出更加客觀真實的結果。FVR 作為貓的常見病，嚴重影響貓科動物生活質量，甚至有致死風險，然而目前尚無特效療法，僅以預防為主。國內現有疫苗數量很少，應盡快研制國產FHV-1 相關疫苗，以解決疫苗短缺及免疫失敗問題，更好地防控FHV-1 相關疾病。