PRRSV GP5 和M 抗原中和表位的融合表達與純化以及間接ELISA 檢測方法的建立

李雷斌，李曉霞，王睿男，周 智，劉玉良，趙柏林，孫 航，馮 冰，陳 玲，王傳彬，李義平，孫 雨

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004；2.中國動物疫病預防控制中心，國家/OIE 豬繁殖與呼吸綜合征參考實驗室，北京 102600）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。PRRSV 為動脈炎病毒科動脈炎病毒屬的成員，是一種有囊膜、不分節段的單股正鏈RNA 病毒，病毒粒子直徑為50～65 nm，表面含有纖突[1]。PRRSV 有美洲和歐洲2 個血清型，我國分離株主要為美洲型。PRRSV 宿主范圍狹窄，主要感染家豬和野豬，可引起動物持續性感染，抗體依賴性增強并發生免疫抑制，導致豬抵抗力下降[2]。患病豬通常表現高熱、呼吸困難、咳嗽、食欲減退、皮膚發紺，以及妊娠母豬流產、癱瘓，仔豬毛發粗亂、精神不振、站立不穩等臨床癥狀。該病患病率可達100%，死亡率可達60%以上。PRRSV 可在豬原代肺泡巨噬細胞和猴腎細胞系及樹突狀細胞中建立感染[3]。PRRSV 于1987 年在美國被首次發現以來，迅速傳遍世界各養豬國家，在豬群密集、流動頻繁的地區更易流行，常造成嚴重經濟損失。近幾年，該病在國內呈現明顯的高發趨勢，對養豬業造成了重大損失，已成為嚴重威脅我國養豬業發展的重要傳染病之一。

PRRSV 的基因組RNA 大小為15 kb，具有5'端帽子結構和3'端Poly（A）尾巴結構。該病毒的主要結構蛋白為GP2a、GP3、GP4、GP5、M、E（GP2b）、N（圖1），其中GP5 和M 蛋白是PRRSV 的主要囊膜蛋白，它們的總含量占病毒蛋白的一半以上，在病毒粒子表面通過二硫鍵連接形成異源二聚體[4]。GP5 是一種含有糖基化位點的蛋白，參與細胞受體識別和病毒中和；M 是一種非糖基化蛋白，主要參與病毒的組裝，可增強宿主對GP5 蛋白免疫反應，產生較強的中和抗體應答，有作為抗原檢測靶標的優勢。此外，GP5 和M 也是刺激機體產生中和抗體的主要蛋白，是基因工程疫苗研究的熱點靶蛋白。

目前，檢測PRRSV 常用的血清試驗有免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）[5]、間接熒光免疫抗體試驗（IFA）[6]、中和試驗（SN）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。IPMA 和IFA 是用于檢測病毒感染后抗體是否表達的經典試驗方法，然而兩者主觀性強，易受操作人員技術和知識水平影響，操作費力，不適合用于大規模樣品的檢測。SN 只能檢測具有中和作用的抗體，不適用于早期病毒的檢查。而ELISA 特異性強，敏感性高，易于操作。基于以上原因，本研究以目前國內流行的NADC30-Like PRRSV 毒株基因序列為擴增模板，全面分析了PRRSV 結構蛋白GP5 和M 的二級結構抗原指數、抗原性、親水性、表面可及性以及潛在中和表位等參數，選取GP5 與M 蛋白的相應中和表位作為免疫原，通過構建帶接頭序列的GP5/M 中和表位融合表達質粒pET-32a-GP5/M，利用大腸桿菌表達系統表達可溶性GP5/M 蛋白，建立了檢測豬體內PRRSV中和抗體的間接ELISA方法，為提高PRRSV 中和抗體檢測和開發PRRSV GP5/M 亞單位疫苗奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與表達菌株構建

NADC30-Like PRRSV 毒株，由中國動物疫病預防控制中心（國家/OIE 豬繁殖與呼吸綜合征參考實驗室）分離并保存。通過對PRRSV 結構蛋白GP5 和M 二級結構序列的抗原指數、抗原性、親水性、表面可及性、可能中和位點等參數進行分析，分別選取了GP5 的47～61、143～156 和186～199 位氨基酸，M 蛋白的63～70、133～146 和156～169 位氨基酸作為免疫候選抗原，并進行序列密碼子篩選優化、接頭（linker）序列柔性連接，構建中和表位抗原表達質粒pET-32a-GP5/M。將構建好的上述質粒轉化入BL21（DE3）感受態細胞，作為GP5/M 的表達菌株。

1.2 主要試劑

2×PCR mix buffer、DNA marker，購自Promega公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購自OXOID 公司；氨芐青霉素、四環素、慶大霉素、X-gal、IPTG、His-tag 抗體、鼠單克隆抗體，購自碧云天生物技術有限公司；鎳瓊脂糖凝膠FF，購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒，購自Beyotime 公司；快速質粒小提試劑盒（離心柱型），購自天根生化科技（北京）有限公司。本試驗中的PRRSV 陽性對照血清、陰性對照血清、相應特異性質控血清與臨床比對血清樣本，均經過血清中和試驗鑒定，并保存于中國動物疫病預防控制中心（國家/OIE 豬繁殖與呼吸綜合征參考實驗室）。

1.3 引物設計

設計1 對GP5/M 引物序列（M-F：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；M-R：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'），由北京六合華大基因科技有限公司合成檢測引物。

1.4 融合蛋白質粒表達

取4 μL pET-32a-GP5/M 轉化BL21（DE3）感受態細胞，涂板；選取陽性質粒接種到5 mL 含50 μg/mL 氨芐青霉素LB 培養基中，37 ℃、220 r/min過夜培養；將活化菌液按1:100 的比例加到500 mL LB 培養基中（含50 μg/mL 氨芐青霉素）37 ℃震蕩培養；當菌液OD600nm值為0.5～0.6 時，加入終濃度為0.75 mmol/L 的IPTG，16 ℃、180 r/min過夜誘導培養。

1.5 質粒提取及PCR 鑒定

取10 mL 菌液使用小提試劑盒提取質粒，具體步驟參照質粒小提試劑盒說明書。將提取質粒、菌液用于PCR 鑒定。PCR 擴增體系25.0 μL：2×TaqPCRMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，引物各1.0 μL，模板2.0 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min。程序結束后，將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余菌液用于離心純化蛋白，將沉淀4 ℃保存。表達成功后，將其命名為融合GP5/M 表位抗原。

1.6 融合表位抗原SDS-PAGE 鑒定與純化

取出4 ℃保存的沉淀，用10 mL Tris-base 進行重懸，超聲破碎菌體；將裂解后的菌體在4 ℃條件下12 000 r/min 離心20 min，取50 μL 離心上清進行SDS-PAGE 電泳分析，考馬斯亮藍染色，鑒定融合GP5/M 表位抗原的表達；將表達后的融合GP5/M 表位抗原使用6×His 蛋白鎳瓊脂糖凝膠柱進行親和層析純化。

1.7 融合表位抗原質量濃度測定及Western Blotting 鑒定

使用BCA 蛋白質定量試劑盒檢測GP5/M 濃度。BCA 標準品按表1 進行稀釋制作標準曲線，OD560nm條件下測定融合GP5/M 表位抗原的濃度，具體步驟按說明書進行。取融合GP5/M 表位抗原與2×上樣緩沖液各50 μL 混勻，放置金屬浴100 ℃變性10 min；取30 μL 樣品上樣，12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉PVDF 膜，脫脂奶4 ℃封閉過夜；按稀釋度為1:2 000 孵育對照血清90 min，TBST洗滌5 次，每次7 min；孵育HRP 標記的抗豬二抗60 min，稀釋度為1:20 000，DAB 顯色試劑液顯色。

表1 BCA 蛋白質量濃度標準稀釋度

1.8 ELISA 檢測方法的建立

1.8.1 抗原包被濃度確定 將融合GP5/M（原始質量濃度為0.25 mg/mL）表位抗原用pH9.6 碳酸鹽包被液按1:20、1:50、1:100、1:200、1:300、1:600、1:1 200、1:3 000、1:6 000 進行稀釋，100 μL/孔加到ELISA 酶標板中，37 ℃孵育2 h；用PBST洗滌5 次，5%的脫脂奶250 μL/孔37 ℃封閉2 h，洗滌步驟同上；加入按1:100 稀釋的陽性對照（PRRSV 陽性血清）和陰性對照（SPF 豬血清）各兩孔，37 ℃孵育1 h；用PBST 洗滌，加入按1:20 000 稀釋的HRP 標記的抗HRP 標記的抗豬二抗（100 μL/孔），孵育30 min；PBST 洗滌，加顯色液（100 μL/孔）室溫顯色5 min 后加終止液（100 μL/孔），測陽性對照和陰性對照OD450nm值；選取P/N（陽性平均值/陰性平均值）最優值作為最佳的包被濃度。

1.8.2 封閉及稀釋條件確定 按已經確定的抗原包被濃度包被ELISA 酶標板，摸索確定封閉液（5%脫脂奶、1%魚明膠、1%BSA）和稀釋液（5%脫脂奶、1%魚明膠、0.67%BSA），以棋盤滴定的方式進行3 次重復試驗。

1.8.3 血清樣本和HRP 標記抗豬二抗最佳稀釋倍數確定 按上述摸索好的步驟進行試驗，將對照血清樣本和HRP 標記抗豬二抗稀釋度分別設置為1:20、1:50、1:100、1:200、1:500，各設兩個陰陽對照，OD450nm條件下進行檢測。選取P/N最優值作為最佳對照血清樣本和HRP 抗豬標記二抗稀釋倍數。

1.8.4 血清樣本與HRP 標記二抗及底物反應時間確定 在ELISA 酶標板中加入陰陽對照各兩孔，將PRRSV 陽性對照血清、陰性對照血清和HRP 標記二抗的孵育時間分別設置為30、45、60 min，底物顯色時間分別設置為5、10、15 min，測OD450nm值，選取P/N最優值確定最佳的PRRSV 陽性對照血清、陰性對照血清和HRP 標記二抗及底物孵育時間。

1.9 ELISA 陰陽性臨界值確定

將本實驗室保存的400 份經血清中和試驗檢測為陰性的豬血清進行間接ELISA 檢測，計算該400 份血清的平均值（X）和標準偏差（SD）。當OD450nm≥X+3SD 判為陽性，OD450nm＜X+3SD 判為陰性。

1.10 試驗驗證

1.10.1 特異性試驗 利用建立的間接ELISA 方法對豬瘟病毒、O 型口蹄疫病毒、A 型口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒、豬肺炎支原體等其他豬病病原的陽性質控血清進行檢測，觀察PRRSV 與其他病原有無交叉反應。

1.10.2 敏感性試驗 將已知的PRRSV 陽性血清進行倍比稀釋，采用建立的間接ELISA 方法進行檢測，同時采用血清中和試驗作對比，得出陽性臨界值時的最大稀釋度。

1.10.3 重復性試驗 采用建立的間接ELISA 方法對10 份豬血清在同批次板和不同批次板上分別進行檢測，平行測定5 次，計算批內、批間變異系數（CV）。

1.10.4 符合性試驗 采用建立的間接ELISA 方法與血清中和試驗，對420 份臨床血清進行平行檢測，計算符合率。

2 結果與分析

2.1 融合表位抗原模式及PCR 鑒定

分別取2 μL 質粒和菌液進行PCR 鑒定，用水作為陰性對照。結果（圖2～3）顯示：菌液和質粒均出現特異性擴增條帶，條帶位于融合表位抗原相對分子質量大小位置，說明質粒構建成功。

2.2 SDS-PAGE 鑒定

使用IPTG 對融合表位抗原菌液誘導表達后進行破碎離心處理，對上清進行SDS-PAGE 分析。結果（圖4）顯示：上清液有特異性條帶出現，但含有很多雜帶。這表明融合表位抗原沒有純化，存在較多雜蛋白。

2.3 純化后抗原SDS-PAGE 分析

將離心上清通過鎳柱純化，收取純化后的洗脫蛋白進行SDS-PAGE 分析。結果（圖5）顯示，融合表位抗原在相應分子質量大小處出現特異性條帶且純化效率較高。

2.4 BCA 蛋白質量濃度測定

用梯度稀釋標準液測定蛋白質量濃度的結果（圖6）顯示：GP5/M 抗原原液OD560nm為0.377，代入公式，融合表位抗原質量濃度為0.28 mg/mL；將抗原稀釋1 倍，測得OD560nm為0.326，融合表位抗原質量濃度為0.22 mg/mL。取兩者的平均值，即融合表位抗原最終質量濃度為0.25 mg/mL。

2.5 融合表位抗原Western Blotting 分析

結果（圖7）顯示：未純化的GP5/M 上清抗原、純化的GP5/M 上清抗原和溶解的沉淀抗原均與陽性血清反應出現特異性條帶。

2.6 表位抗原ELISA 檢測方法建立

2.6.1 最佳包被質量濃度測定 結果（表2）顯示，P/N最優值為12.445，此時抗原的質量濃度為50 ng/100 μL，因此將該質量濃度設定為最佳的抗原包被質量濃度。

表2 抗原包被質量濃度測定結果

2.6.2 表位抗原封閉液及稀釋液選擇 結果（表3）顯示，P/N最優值為6.348，即確定的封閉液為5%脫脂奶，稀釋液也為5%脫脂奶。

2.6.3 PRRSV 血清樣本稀釋比例確定 結果（表4）顯示：P/N最優值為7.524，即PRRSV 陽性對照血清、陰性對照血清的稀釋比例為1:50。

2.6.4 HRP 標記二抗反應濃度確定 結果（表5）顯示：將HRP 標記的抗豬二抗稀釋后，P/N最優值為6.866，此時HRP 標記的抗豬二抗的稀釋比例為1:10 000。

表5 HRP 標記二抗反應濃度確定結果

2.6.5 PRRSV 血清樣本與HRP 標記二抗反應時間確定 結果顯示（表6）：P/N最優值為16.763，此時PRRSV 血清的反應時間為30 min，HRP 標記二抗的反應時間為45 min。

表6 PRRSV 對照血清樣本和HRP 標記二抗不同反應時間測定結果（OD 值）

2.6.6 底物顯色時間確定 結果（表7）顯示：P/N最優值為15.515，即顯色的最佳時間確定為5 min。

表7 底物顯色時間確定結果（OD 值）

2.7 融合GP5/M 表位抗原ELISA 優化

經過條件摸索，最終確定ELISA 檢測條件。包被：用pH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋融合GP5/M 表位抗原包被ELISA 檢測板（50 ng/孔），每孔加入100 μL，37 ℃孵育2 h；封閉：取出酶標板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，每孔加入250 μL 5%脫脂奶，37 ℃封閉2 h；一抗孵育：出酶標板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，每孔加入100 μL 按1:50 稀釋的標準陰性和陽性血清，每孔100 μL，置于37 ℃孵育30 min；酶標二抗孵育：取出酶標板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，加入1:10 000稀釋的酶標抗HRP標記的抗豬二抗，每孔100 μL，置于37 ℃孵育45 min；顯色：取出酶標板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，加入100 μL 底物顯色液，在室溫下顯色5 min；終止反應：加入終止液，每孔100 μL，檢測OD450nm值，記錄結果。

2.8 ELISA 陰陽性臨界值確定

采用建立的間接ELISA 檢測方法，對400 份豬陰性血清進行檢測，測定OD450nm值。400 份陰性血清平均值X為0.174，SD 為0.058，因此陰陽性臨界值X+3SD=0.348。

2.9 驗證試驗

2.9.1 特異性試驗 采用建立的間接ELISA 方法對6 種豬源病原（豬瘟病毒、O 型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒、豬肺炎支原體）陽性血清進行檢測，其OD450nm值分別 為0.174、0.151、0.184、0.193、0.146、0.183，均小于臨界值0.348，表明重組蛋白與這6 種病原的陽性血清均無交叉反應，該間接ELISA 方法具有良好的特異性。

2.9.2 敏感性試驗 將血清中和試驗鑒定的PRRSV 陽性對照血清從1:25 開始進行倍比稀釋，采用重組蛋白作為包被抗原進行檢測，稀釋度為1:12 800 時仍呈陽性，表明該方法敏感性較好。

2.9.3 重復性試驗 以不同效價血清稀釋50 倍后做平行重復ELISA 檢測。結果顯示（表8）：批內重復變異系數（CV）為2%～10%，批間重復變異系數（CV）小于15%。結果表明，建立的間接ELISA 檢測方法具有良好的重復性。

表8 間接 ELISA 重復性試驗結果

2.9.4 符合性試驗 分別采用本研究建立的間接ELISA 檢測方法與血清中和試驗，對實驗室保存的420 份臨床血清樣本進行檢測。結果顯示，該間接ELISA 方法檢測的樣本陽性率為52.86%，血清中和試驗檢測的樣本陽性率為48.10%，總符合率為95.24%，符合性良好。

3 討論

本研究成功表達了融合GP5/M 表位抗原。Western Blotting 和BCA 蛋白濃度測定結果表明，融合GP5/M表位抗原在原核系統中得到高效表達。為了快速檢測PRRSV，利用融合GP5/M 表位抗原制備ELISA 酶標板。研究發現，包被ELISA 酶標板時，融合GP5/M 表位抗原按50 ng/孔作為包被濃度，臨床血清和HRP 標記的抗豬二抗分別按1:50 和1:10 000 稀釋，臨床血清、HRP 標記的抗豬二抗、底物顯色時間分別按30、45、5 min 時，測定的OD450nm值最高。將抗原稀釋至5 ng/孔時，OD450nm值仍具有較高值，使用融合GP5/M 表位抗原作為包被抗原時，敏感性和特異性較高，說明其具有較高的現場應用潛力。

PRRSV 結構蛋白GP5 是一種糖基化膜蛋白，可以通過與宿主細胞受體相互作用而在病毒侵入過程中發揮作用[7]。結構蛋白M 是一種非糖基化膜蛋白，可增強GP5 的中和活性，二者通過二硫鍵相連形成的異二聚體是病毒感染過程中不可或缺的一部分。Van 等[8]研究發現，GP5/M 糖蛋白復合體可與唾液酸依賴的唾液酸黏附素受體結合，促進病毒與細胞受體的識別。Jiang 等[9]研究發現，GP5/M 融合蛋白的免疫應答水平明顯高于M 蛋白。基于以上，本研究通過原核表達系統表達的融合GP5/M 表位抗原，具有較強的免疫原性，能更好地檢測PRRSV 病毒血清。

自PRRSV 發現以來，結構蛋白一直是人們研究的熱點。結構蛋白在病毒感染過程中起著非常重要的作用——參與宿主細胞受體的識別，增強病毒的感染能力，抑制宿主細胞正常的細胞免疫和體液免疫。其中，結構蛋白GP5 一直深受研究人員的青睞，主要原因是糖蛋白GP5 是PRRSV 含量最豐富的包膜糖蛋白，也是中和抗體的關鍵靶點[10]。Wang等[11]利用GP5 包被ELISA 酶標板，發現GP5 是一種良好的診斷抗原，包被的ELISA 具有較高的特異性，與其他豬病原體并無交叉反應。Du 等[12]研究發現，利用PRRSV GP5 制作的疫苗能夠增強宿主細胞粘膜免疫應答反應。以上研究主要針對單一抗原進行了試驗，只了解了一種抗原的特性。近年來，很多研究者通過將兩種或者三種結構蛋白融合起來，研究融合蛋白的功能及特性。蔣文明等[13]通過串聯表達PRRSV GP3、GP4、GP5 蛋白免疫小鼠，發現串聯表達的病毒蛋白能夠誘導產生更高水平的體液免疫應答反應。Jiang 等[14]發現，融合蛋白GP5/M 能與PRRSV 抗血清特異性反應，臨床血清中融合蛋白GP5/M 的ELISA 抗體反應（OD630nm）與其特異性中和滴度之間沒有顯著相關性。本實驗室通過分析PRRSV 結構蛋白GP5和M 的抗原性、親水性等，選取了病毒結構蛋白GP5 和M 序列的優勢位點使基因序列長度更小，剔除了病毒中產生免疫逃逸機制的位點序列，其親水性、空間結構、免疫效果更佳，這些改變提高了其作為ELISA 抗原使用的靈敏度和特異性。此外，對融合GP5/M 中和表位抗原的認識，為今后研究以GP5/M 為對象研制亞單位疫苗奠定了基礎。

近年來，國內外針對PRRSV 中和抗體檢測的診斷技術研究較多。目前市場上銷售的用于檢測PRRSV 抗體的試劑盒主要為國外進口，價格十分昂貴，且不能準確檢測動物體內的中和抗體水平，給基層PRRSV 抗體檢測和監測工作的開展帶來一定困難。本研究以高濃度可溶性的重組中和表位蛋白作為包被抗原，優化建立的間接ELISA 檢測方法具有良好的特異性、敏感性與重復性，與其他幾種豬源疫病病原的陽性血清無任何交叉反應。取陽性值較高的豬血清進行稀釋后測定OD450nm值，同時與血清中和試驗做對比，發現符合率達到95.24%，表明該方法具有較好的敏感性和重復性，進一步完善可成為成熟產品，適用于基層PRRSV免疫效果監測等實際工作，具有較強的應用價值和前景。