基于CRISPR 序列的腸道沙門氏菌分離株CSST 分型

徐 越，張麗霞，王茜月，管飄萍，劉文博

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌[1]。污染的生雞蛋、蛋制品和未充分加熱的肉品是人類感染沙門氏菌的主要途徑，在我國70%～80%的食源性細(xì)菌病是由沙門氏菌引起的[2]。沙門氏菌屬是腸桿菌科的重要成員，有2 個種、42 個血清群、2 500 多個血清型，我國已報道的血清型達(dá)240 種以上[3]。不同血清型沙門氏菌的侵襲力與致病力顯著不同，所以探尋沙門氏菌的分型方法對鑒別控制由其引起的疾病具有重要意義。

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是細(xì)菌防御外源遺傳物質(zhì)入侵的“免疫機(jī)制”[4]。CRISPR 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)可以簡單描述為由前導(dǎo)序列（leader）、重復(fù)序列（direct repeats）、間隔序列（spacers）以及CRISPR相關(guān)蛋白基因（cas）組成[5]，其中重復(fù)序列和間隔序列相互交錯組成CRISPR 位點。而本試驗的分類依據(jù)——間隔序列，來源于外源核苷酸，且可以用來抵御同源的外源核苷酸入侵，所以間隔序列中包含著細(xì)菌遺傳進(jìn)化信息[6]及其特有的生態(tài)學(xué)、地理學(xué)信息。CRISPR 序列的長度取決于間隔序列的數(shù)量，其在不同有機(jī)體之間以及不同細(xì)菌血清型或菌株之間差異很大，而這些信息均可以用來對含有此結(jié)構(gòu)的細(xì)菌進(jìn)行分型[7]。

沙門氏菌基因組中也存在這種“免疫機(jī)制”，其包含著沙門氏菌的遺傳進(jìn)化信息，因而能夠用于沙門氏菌分型[8]。沙門氏菌存在2 個CRISPR 位點——CRISPR1 和CRISPR2。根據(jù)這兩個位點的各種信息可以對沙門氏菌進(jìn)行分型，尤其是因為間隔序列的插入或丟失，形成了間隔區(qū)特有的多態(tài)性，間接造成了細(xì)菌CRISPR 位點的多態(tài)性。所以利用CRISPR 序列中間隔序列的順序作為細(xì)菌分型依據(jù)的方法逐漸得到應(yīng)用。這種方法分辨力高，在亞型的分型中也有較好的前景。傳統(tǒng)CRISPR 分型方法需要測出沙門氏菌2 個CRISPR 位點的全部間隔序列，并且需將全部間隔序列繪制成間隔序列圖譜，再根據(jù)圖譜進(jìn)行細(xì)菌分型，雖然分辨率較高，但耗時耗力。目前已出現(xiàn)了許多新型的CRISPR 分型方法。例如：CRISPR 基因可以與毒力基因結(jié)合形成CRISPR-MVLST，從而對細(xì)菌進(jìn)行分型，其在對腸道沙門氏菌分型中優(yōu)于PFGE 分型方法；還有CLSPT（CRISPR loci spacer-pair typing）分型方法，各取CRISPR1 和CRISPR2 中靠近leader 的1 個間隔序列繪制圖譜進(jìn)行分型[9]，但分型效果不佳；經(jīng)改良還出現(xiàn)了各取3 個距離leader 最遠(yuǎn)或者是菌株進(jìn)化過程中最先插入3 個間隔序列的CSST（CRISPR initial three spacers sequence typing） 分型方法[8]。這種方法既保留了CLSPT 分型方法快速、高效、簡單的優(yōu)點，又補(bǔ)足了CLSPT 分型方法的不足，而且還延續(xù)了傳統(tǒng)CRISPR 分型方法的準(zhǔn)確性，同時又不需要耗時耗力地測出并繪制全部間隔序列。為驗證CSST 分型方法的可行性，本試驗先采用傳統(tǒng)CRISPR 分型方法進(jìn)行測序，然后在數(shù)據(jù)分析階段分別用傳統(tǒng)CRISPR 分型方法和CSST 分型方法對20 株腸道沙門氏菌進(jìn)行分型。

1 材料

1.1 菌種

24 株雞源腸道沙門氏菌，2013—2017 年從江蘇省分離（由于試驗操作等原因，有4 株被剔除，只有20 株參與分型分析），由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室分離鑒定保存，信息見表1。

表1 菌株信息

1.2 主要儀器

生物安全柜，型號CLASS2 YPEA2，購自Thermo 公司；電子天平，型號FA2004，購自上海精密儀器儀表有限公司；奧林巴斯顯微鏡，型號BX53，購自日本奧林巴斯公司；高壓滅菌鍋，型號SX500，購自Tomy 公司；PCR 儀，型號9902，購自美國ABI 公司；電泳儀電泳凝膠成像系統(tǒng)，型號PowerPacTMBasicUniversal Hood II，購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 主要試劑

SS 瓊脂，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 CRISPR 引物

參照莊孝飛[7]設(shè)計的引物（表2），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 CRISPR 引物序列信息

2 方法

2.1 菌株復(fù)蘇

挑取解凍菌液劃線接種于無菌SS 瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后選取單個菌落繼續(xù)純化培養(yǎng)。

2.2 菌株鑒定

采用16S rRNA 基因擴(kuò)增和BLAST 序列分析方法進(jìn)行菌株鑒定[10]。PCR 擴(kuò)增體系（總體積為25.00 μL）：Mix 12.50 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，ddH2O 10.00 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10.0 min；94 ℃變性1 min，60.5 ℃/52.0 ℃（CRISPR1、2 位點引物的退火溫度見表2）退火1.0 min，72 ℃延伸1.5 min，共50 個循環(huán)；72 ℃延伸5.0 min，4 ℃保存。

采用煮沸裂解法制備細(xì)菌基因組模板：挑取純培養(yǎng)后的單個菌落放于裝有200 μL 滅菌雙蒸水的滅菌管中，100 ℃處理10 min，5 000 r/min 離心5 min，取上清作為PCR 模板，根據(jù)TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增；取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將大小正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，送南京擎科生物工程有限公司測序。

2.3 CRISPR 分型

參照2.2 的PCR 方法，以及CRISPR1、CRISPR2 位點引物的退火溫度（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增；配制1%瓊脂糖凝膠，取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；電泳結(jié)束后，EB 染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察記錄結(jié)果；將純化的DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送南京擎科生物工程有限公司測序。

2.4 數(shù)據(jù)分析

將20 株不同血清型沙門氏菌菌株CRISPR1和CRISPR2 位點序列拼接得到相關(guān)序列。

借助CRISPR 數(shù)據(jù)庫中的在線工具CRISPR finder（http://crispr.u-psud.fr/Server/）找出序列中的間隔序列及重復(fù)序列；將其中的重復(fù)序列去掉，保留間隔序列且賦予不同的背景顏色，再將其按順序組合在一起，繪制成CRISPR1 和CRISPR2 間隔序列圖譜。對于相同血清型來說，一種顏色表示一種間隔序列，不同顏色表示不同的間隔序列，重復(fù)的間隔序列則用相同的顏色表示；對于不同血清型而言，不同間隔序列用不同形狀和顏色表示，與其他血清型序列相同的間隔序列用已有顏色表示，但不同血清型之間，表示間隔序列的形狀不同。

本試驗所用菌種皆為腸道沙門氏菌，所以間隔序列均選用矩形表示。傳統(tǒng)CRISPR 分型，取CRISPR1 和CRISPR2 的全部間隔序列繪成圖譜；而CSST 分型，取CRISPR1 和CRISPR2 序列中前3 個間隔序列繪成圖譜。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株復(fù)蘇

SS 瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)中間黑色、邊緣灰白色的透明小菌落，且沒有雜菌生長。

3.2 菌株鑒定

測序序列經(jīng)過BLAST 序列分析，確定20 株細(xì)菌均為腸道沙門氏菌，分為4個血清變異亞型（表3）。

表3 20 株沙門氏菌分離株的血清亞型

3.3 CRISPR 分型

3.3.1 瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果（圖1～2）顯示：20 株腸道沙門氏菌的CRISPR1、CRISPR2 條帶大小差異較小，其中CRISPR1 均為650 bp 左右，CRISPR2 均為450 bp 左右（10 號孔D24 菌株條帶略小）。

3.3.2 重復(fù)序列 20 株沙門氏菌的CRISPR1 位點處第一個重復(fù)序列均為5'-CGTGTTTATCCCCGCTGACGCGGGGAAACT-3'，固定重復(fù)序列（repeat sequence）均為5'-CCGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3'；CRISPR2 位點處的第一個重復(fù)序列均為5'-ACGGCTATCCTTGTTGGCGCGGGGAACAC-3'，固定重復(fù)序列（repeat sequence）均 為5'-CGGTTTATCCCCGCTGACGCGGGGAACAC-3'。本試驗的20 株菌株，根據(jù)16S rRNA 基因分型方法[10]分為4 種亞型。各菌株CRISPR1、CRISPR2 位點處的第一個重復(fù)序列和固定重復(fù)序列（repeat sequence）均相同，說明這兩個重復(fù)序列在沙門氏菌種內(nèi)相對保守[11]。

3.3.3 間隔序列 本試驗共測出4 種CRISPR1 間隔序列，41 種CRISPR2 間隔序列（圖3）。在同種腸道沙門氏菌中，CRISPR2 間隔序列的種類比CRISPR1 豐富的多（圖4），說明CRISPR2 是同種亞型沙門氏菌進(jìn)化較快的序列。此外還發(fā)現(xiàn)，許多間隔序列同源性很高，例如2.8、2.12、2.33、2.40間隔序列，還有2.9、2.13、2.18、2.34、2.41 間隔序列（表4），與Fei 等[12]試驗得出的一些間隔序列有較高同源性的結(jié)果相一致。

表4 部分腸道沙門氏菌菌株測出的CRISPR 基因中相似間隔序列

3.3.4 傳統(tǒng)CRISPR 分型 20 株臨床腸道沙門氏菌被分成了15 種亞型，其中CR4 和CR9 為最優(yōu)勢CR 型，分別占總數(shù)的20%和15%，其他CR型呈零星分布（表5、圖5）。

表5 20 株沙門氏菌15 種CRISPR 分型結(jié)果

3.3.5 CSST 分型 20 株臨床腸道沙門氏菌被分成了15 種亞型，其中CT4 和CT9 為最優(yōu)勢CT 型，其他CT 型均呈零星分布（表6、圖6），與傳統(tǒng)CRISPR 分型完全一致。

表6 20 株沙門氏菌CSST 分型結(jié)果

4 討論

CRISPR 序列不僅可以作為沙門氏菌的“免疫機(jī)制”，而且其中的重要結(jié)構(gòu)——間隔序列也在沙門氏菌分型中有著重要作用。間隔序列在進(jìn)化中具有良好的“時鐘”性質(zhì)，所以其包含著沙門氏菌的獨(dú)特分子“指紋”遺傳進(jìn)化等信息，使其除了能夠用于沙門氏菌與其他表型類似菌種的區(qū)分，還能用于沙門氏菌種間的分型。本試驗是根據(jù)沙門氏菌存在2 個CRISPR 位點（CRISPR1 和CRISPR2）的間隔序列信息進(jìn)行20 株沙門氏菌的種間分型：先采用傳統(tǒng)CRISPR 分型方法，然后在數(shù)據(jù)分析階段分別用傳統(tǒng)CRISPR 分型方法和CSST 分型方法，對20 株腸道沙門氏菌進(jìn)行分型，均成功將20 株臨床腸道沙門氏菌分成了15 種亞型，驗證了CSST分型方法取代傳統(tǒng)CRISPR 分型方法的可行性。

由本試驗結(jié)果得知，腸道沙門氏菌CRISPR1的保守性較CRISPR2 高，推測CRISPR2 進(jìn)化的發(fā)生較CRISPR1 晚。根據(jù)CRISPR2 間隔序列具有一定同源性，猜測在沙門氏菌獲得外源性DNA 且用其來防御同源序列的入侵者過程中。每個細(xì)菌最初獲得的外源DNA 并不完全一樣，隨后根據(jù)環(huán)境以及細(xì)菌生存情況留下最適宜的外源核苷酸片段，所以會留下同源性較高的CRISPR2 間隔序列，但這還需進(jìn)一步證明。從圖3 可以看出，CRISPR 間隔序列的大小差異不大，具有一定保守性，最大的為38 bp（編號2.34 的間隔序列），最小的為32 bp。

通過圖5～6 可以發(fā)現(xiàn)：20 株腸道沙門氏菌CRISPR1 的3 個間隔序列相似性很高，可以用其作為腸道沙門氏菌與其他細(xì)菌的分型依據(jù)；而CRISPR2 的間隔序列種類很多，同源性較CRISPR1 略低，但其依舊具有一定的保守性。因此，CRISPR1 適合用于細(xì)菌種的分型，而CRISPR2 可以用于更細(xì)致的分型，例如亞型的分型，但這需更進(jìn)一步研究。

由試驗可知，使用傳統(tǒng)CRISPR 分型方法，20 株腸道沙門氏菌被分成了15 種CRISPR 型（簡稱CR 型）。由于試驗菌株較少，無法得出16S rRNA 分型方法與CRISPR 分型方法的聯(lián)系與不同，但CSST 分型方法的分型結(jié)果與傳統(tǒng)CRISPR 分型方法完全一致。

本試驗所用的20 株菌株為本實驗室在不同時間從江蘇省不同養(yǎng)殖場分離得到的，其CRISPR 分型和CSST 分型結(jié)果與時間、地點等因素沒有明顯關(guān)聯(lián)。但不同時間或地點的菌株屬于同一CR/CT型（CR4/CT4 型、CR9/CT9 型），說明同種CR/CT 型的腸道沙門氏菌在江蘇省持續(xù)存在，且沿著某種傳播途徑傳播，這為控制腸道沙門氏菌進(jìn)一步傳播提供了指導(dǎo)。菌株的CR/CT 型相同，即菌株CRISPR 的間隔序列相同，其中包含的遺傳進(jìn)化信息、生態(tài)學(xué)和地理學(xué)信息也相同，這為研究菌株的起源和進(jìn)化提供了重要信息。

本試驗證明，采用CSST 分型方法替代傳統(tǒng)CRISPR 分型方法是可行的，在專屬于CSST 分型方法的引物出現(xiàn)之前，二者的試驗方法是一致的，在試驗階段并無優(yōu)劣之分。但在數(shù)據(jù)分析階段，傳統(tǒng)CRISPR 分型需要取CRISPR1 和CRISPR2 的全部間隔序列繪成圖譜，而繪制圖譜則需要去掉重復(fù)序列并將每一種間隔序列賦予不同的背景顏色，再將其按順序組合在一起；而對于不同血清型而言，不同間隔序列還要用不同的形狀來表示。因此，在用CRISPR 間隔序列對沙門氏菌進(jìn)行分型時，所選取的間隔序列越少越好，但間隔序列太少又不能保證分型方法的準(zhǔn)確性和精確度，所以需要取CRISPR1 和CRISPR2 序列中距離leader 最遠(yuǎn)或者是菌株進(jìn)化過程中最先插入的3 個間隔序列繪成圖譜的CSST 分型方法成為最優(yōu)的嘗試。本試驗結(jié)果顯示，CSST 分型方法與傳統(tǒng)CRISPR 分型方法的分型結(jié)果完全一致，在試驗方法相同的前提下，CSST 分型方法數(shù)據(jù)分析更加省時省力，有著快速、高效、簡單的優(yōu)點，且還延續(xù)了傳統(tǒng)CRISPR分型方法的準(zhǔn)確性，可替代數(shù)據(jù)分析繁瑣的傳統(tǒng)CRISPR 分型方法，成為流行病學(xué)溯源的重要技術(shù)方法。