大腸桿菌及脂多糖對奶牛乳腺上皮細胞基質金屬蛋白酶表達的影響

張媛媛，丁玉林，劉雅鑫，李曉華，高 瓊，王鳳龍

（內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古呼和浩特 010018）

奶牛乳腺炎是乳腺組織受到病原微生物感染或理化因素刺激等發生的炎癥反應，可導致奶牛泌乳量減少、奶品質下降、生長發育減緩、繁殖力降低、產奶年限縮短和死淘率上升[1]。奶牛乳腺炎可導致乳腺纖維化，主要病理變化為乳腺組織內纖維結締組織增多，實質細胞減少，持續進展可使乳腺結構破壞和功能減退[2]。奶牛乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）具有天然免疫功能，在感染的早期，能夠及時識別病原并釋放細胞因子，以阻止病原侵入和增殖，并介導表達促炎因子誘導的炎癥反應。在炎癥后期，細胞再生與肉芽組織增生修復損傷使上皮細胞發生轉分化，形成活化的肌纖維母細胞，進而引發纖維化[3]。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度合成、分解ECM 的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達受阻或是基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissuse inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）的過度表達，是組織器官纖維化的主要原因[4-5]。MMPs 是一類依賴于Zn2+/Ga2+等金屬離子的內肽酶，能夠降解ECM 的不同成分[6]。MMPs 的催化活性主要在基因表達、酶原激活和特異性抑制劑（金屬蛋白酶組織抑制劑TIMPs 和非特異性蛋白酶抑制劑）3 個方面受到調控。尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）系統主要包含uPA、uPAR和PAI-1。uPA可以催化纖溶酶原（Plg）轉化為有活性的纖溶酶，在ECM 蛋白降解過程中發揮作用[7]；PAI-1 通過調節ECM 的降解和沉積、刺激細胞增殖、調節細胞的黏附作用等過程，參與組織器官纖維化等疾病的發展[8]。

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一，是一種無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌[9]。它是條件性致病菌，通常大多數作為正常菌群存在于機體胃腸道中，少部分在一定條件下引起組織器官感染[10]。由大腸桿菌導致的乳腺炎多表現為急性，多發生于產奶量高的奶牛[11]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，是脂質和多糖的復合物，可代替革蘭氏陰性菌應用于誘導炎癥的動物和細胞模型[12]。本試驗通過研究大腸桿菌和LPS對BMECs MMPs/TIMPs 和uPA 系統表達的影響，以闡明MMPs/TIMPs 和uPA 系統在調控ECM 代謝中的作用，從而進一步闡明大腸桿菌感染奶牛乳腺組織導致乳腺纖維化的發病機理，為研究奶牛乳腺炎和乳腺纖維化藥物提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料準備

1.1.1 主要試劑 LPS，購自InvivoGen 公司；Multisource Total RNA Miniprep Kit，購自AXYGEN公司；全蛋白提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉錄試劑盒、qPCR 試劑盒，均購自TaKaRa 公司；DMEM/F12 培養基，購自Gibco 公 司；MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1兔單抗，購自Proteintech 公司；β-actin 鼠單抗、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP 二抗，均購自天津三箭生物技術股份有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；ECL 顯色液，購自Thermo 公司；蛋白預染Marker，購自Bio-Rad 公司；MMP-2 和MMP-9 明膠酶譜法檢測試劑盒，購自上海信帆生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒，購自Biosharp 公司。

1.1.2 菌種及細胞 大腸桿菌菌種，由本實驗室分離、鑒定并保存，BMECs 由本實驗室保存備用[13]。

1.1.3 熱滅活菌液制備 參考趙楠[14]的試驗方法，制備熱滅活的大腸桿菌菌液。

1.1.4 BMECs 復蘇及培養 將實驗室凍存的第3代BMECs 復蘇培養，按1×105個/mL 接種于細胞瓶，傳代后使用無胎牛血清（FBS）DMEM/F12培養液饑餓處理24 h 進行后續試驗。

1.1.5 刺激BMECs 的LPS 最佳質量濃度篩選收集對數生長期BMECs 接種于96 孔板，設置對照組（不添加LPS）以及4 個LPS 刺激組（分別添加LPS，使其最終質量濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL），每組3 個重復，同時空白對照僅添加基礎培養基；將96 孔板置于37 ℃恒溫培養箱繼續孵育6 h 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續在培養箱中孵育4 h，用酶標儀測定OD600nm，以細胞抑制率（IR）≤10%為判斷標準，確定LPS最佳刺激濃度。IR=（LPS 刺激組OD600nm-空白組OD600nm）/（對照組OD600nm-空白組OD600nm）×100%。經計算，7.5 μg/mL LPS 為刺激BMECs 的最佳劑量。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液和LPS 處理細胞 待BMECs 生長至第7 代并鋪滿細胞瓶時，用無FBS 的DMEM/F12 培養基饑餓處理細胞24 h。對照組為無FBS 培養基；試驗組分為熱滅活大腸桿菌菌液（106CFU/mL）處理組，LPS（7.5 μg/mL）處理組，以及大腸桿菌、LPS 聯合作用組（簡稱聯合作用組）。將大腸桿菌菌液及LPS 加入細胞瓶中作用6、12、24、48 h后，收集細胞上清用于明膠酶譜檢測，提取細胞總RNA 用于RT-qPCR 檢測，提取細胞總蛋白用于Western blot 試驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測 提取各組細胞的總RNA，通過酶標儀測得各組RNA 濃度和純度，參考反轉錄試劑盒說明書進行cDNA 制備。qPCR反應體系參考TB?Premix ExTaq? II 說明書，并于Quant StudioTM7 Flex Real-Time PCR System 儀器進行試驗。設計β-actin、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1基 因引物序列（表1）。以β-actin作為內參基因，檢測MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1mRNA 轉錄水平，并重復3 次試驗。結果采用2-ΔCT法分析，所得數據用Graph Pad Prism 5 作圖，并進行雙因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 及P＜0.001 均為差異極顯著。

表1 BMECs 目的基因引物信息

1.2.3 Western blot 檢測 提取各組細胞總蛋白，BCA 法測定各組蛋白樣品濃度；設定蛋白的統一上樣量為20 μg，加入蛋白上樣緩沖液，經金屬浴100 ℃變性5 min 后，置于-80 ℃保存；參考Solarbio 蛋白凝膠試劑盒說明書操作，配制SDSPAGE 凝膠進行試驗，使用對應的抗體孵育，采用ECL 顯色試劑盒顯影拍照，檢測MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1 蛋白表達情況。結果利用Image J 進行灰度分析，所得數據用Graph Pad Prism 5 作圖，并進行雙因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01及P＜0.001均為差異極顯著。

1.2.4 明膠酶譜檢測 制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠，用收集的各組細胞上清與2×SDS-PAGE nonreducing buffer 按照體積比1:1混合，上樣，在110 V 電壓下進行凝膠電泳；分別用明膠酶譜檢測試劑盒1×Buffer A、1×Buffer B孵育凝膠，考馬斯亮藍染色液染色后，再用脫色液脫去浮色；將凝膠放在掃描儀上掃描，透亮區域即為MMP-2、MMP-9 的活性位置。結果利用Image J 進行灰度分析，所得數據用Graph Pad Prism 5 作圖，并進行雙因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 及P＜0.001 均為差異極顯著。

2 結果

2.1 MMP-2、MMP-9 mRNA 轉錄水平、相應蛋白表達水平及明膠酶譜分析

2.1.1MMP-2、MMP-9mRNA 轉錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-2mRNA 轉錄水平在6 h 時顯著上升，在12 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-2mRNA 轉錄水平在6 h 時顯著下降；聯合作用組MMP-2mRNA 轉錄水平在6 h 時顯著下降（圖1-A）。作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-9mRNA 轉錄水平在6 h 時極顯著上升，在24、48 h 時顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-9mRNA 轉錄水平在48 h 時極顯著上升；聯合作用組MMP-9mRNA 轉錄水平在12、48 h 時極顯著上升（圖1-B）。

2.1.2 MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組、7.5 μg/mL LPS 處理組以及聯合作用組MMP-2 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時均極顯著上升（圖2-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-9 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時均極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-9 蛋白表達水平在12 h 時顯著上升，24、48 h 時均極顯著上升；聯合作用組MMP-9 蛋白表達水平在6 h 時極顯著下降，24、48 h 時均呈極顯著上升（圖2-B）。

2.1.3 MMP-2、MMP-9 蛋白明膠酶譜分析作用6、12、24、48 h 后，利用明膠酶譜法檢測MMP-2 和MMP-9 蛋白活性。結果顯示，可在72 和92 kDa 位置處發現清晰、活化的MMP-2 和MMP-9 蛋白條帶。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-2 活性在6、12、24 h 時均呈極顯著上升，48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-2 活性12、24 h 均呈極顯著上升，48 h 時極顯著下降；聯合作用組MMP-2 活性在6、12、24、48 h 時均極顯著上升（圖3-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-9 活性在12 h時顯著上升，24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-9 活性在12、24、48 h 時極顯著下降；聯合作用組MMP-9 活性在24、48 h 時極顯著下降（圖3-B）。

2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 轉錄水平和相應蛋白表達水平

2.2.1MMP-1、MMP-3、MMP-13mRNA 轉錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL菌液處理組MMP-1mRNA 轉錄水平在6 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-1mRNA 轉錄水平在各時間點轉錄水平差異均不顯著；聯合作用組MMP-1mRNA 轉錄水平在12 h 時極顯著上升（圖4-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組、7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-3mRNA 轉錄水平在各時間點的差異均不顯著；聯合作用組MMP-3mRNA 轉錄水平在12 h 時極顯著上升（圖4-B）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-13mRNA 轉錄水平在12 h 時顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-13mRNA 轉錄水平在12 h 時極顯著上升；聯合作用組MMP-13mRNA轉錄水平在12 h 時極顯著上升（圖4-C）。

2.2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 蛋白表達水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-1 蛋白表達水平在6、12 h 時極顯著下降，24、48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS處理組、聯合作用組MMP-1 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時均極顯著下降（圖5-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-3 蛋白表達水平在6 h 時極顯著上升，24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-3 蛋白表達水平在6、12 h 時極顯著上升，48 h 時極顯著下降；聯合作用組MMP-3 蛋白表達水平在6 h 時顯著上升，12、24 h 時極顯著下降（圖5-B）。106CFU/mL菌液處理組MMP-13 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時均極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-13 蛋白表達水平在12 h 時極顯著下降，在24、48 h 時極顯著上升；聯合作用組MMP-13蛋白表達水平在12、24、48 h 時均極顯著上升（圖5-C）。

2.3 TIMP-1、TIMP-2 mRNA 轉錄水平和相應蛋白表達水平

2.3.1TIMP-1、TIMP-2mRNA 轉錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組TIMP-1mRNA 轉錄水平在6 h 時顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組、聯合作用組TIMP-1mRNA轉錄水平均在6 h 時極顯著下降；（圖6-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組、7.5 μg/mL LPS 處理組TIMP-2mRNA 轉錄水平在各時間點轉錄水平差異均不顯著；聯合作用組TIMP-2mRNA轉錄水平在12 h 時極顯著上升，24 h 時顯著上升（圖6-B）。

2.3.2 TIMP-1、TIMP-2 蛋白表達水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組TIMP-1 蛋白表達水平在在6 h 時極顯著上升，24 h 時顯著下降，48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組TIMP-1 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時極顯著下降；聯合作用組TIMP-1蛋白表達水平在12、24、48 h 時極顯著下降（圖7-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組TIMP-2 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組TIMP-2 蛋白表達水平在6 h 時極顯著上升，12、24、48 h 時極顯著下降；聯合作用組TIMP-2 蛋白表達水平在6、12、48 h 時極顯著下降（圖7-B）。

2.4 uPA、uPAR、PAI-1 mRNA 轉錄水平和相應蛋白表達水平

2.4.1uPA、uPAR、PAI-1mRNA 轉錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL菌液處理組uPAmRNA 轉錄水平在6、12、24、48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPAmRNA 轉錄水平在12 h 時顯著上升；聯合作用組uPAmRNA 轉錄水平在12 h 時極顯著上升（圖8-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組uPARmRNA 轉錄水平在6、12 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPARmRNA 轉錄水平在各時間點轉錄水平差異均不顯著；聯合作用組uPARmRNA 轉錄水平在12 h 時極顯著上升，24 h 時顯著上升（圖8-B）。106CFU/mL 菌液處理組PAI-1mRNA 轉錄水平在6 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組PAI-1mRNA 轉錄水平在6 h 時極顯著下降；聯合作用組PAI-1mRNA 轉錄水平在6 h 時極顯著下降（圖8-C）。

2.4.2 uPA、uPAR、PAI-1 蛋白表達水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組uPA 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時均極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPA 蛋白表達水平在6 h 時顯著上升，12、24、48 h 時均極顯著下降；聯合作用組uPA 蛋白表達水平在6、24 h時極顯著下降，48 h 時極顯著上升（圖9-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組uPAR 蛋白表達水平在12、24 h 時極顯著下降，48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPAR 蛋白表達水平在6、24、48 h 時極顯著上升，12 h 時極顯著下降；聯合作用組uPAR 蛋白表達水平在6、12、48 h時極顯著上升（圖9-B）。106CFU/mL 菌液處理組PAI-1 蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組、聯合作用組PAI-1蛋白表達水平在6、12、24、48 h 時均極顯著上升（圖9-C）。

3 討論

當奶牛乳頭、乳房通過創口或擠乳器被大腸桿菌污染，可引起乳腺感染[15]。LPS 的分子結構特殊，為革蘭氏陰性菌細胞壁的最外層結構，具有抗原性與毒性[16]。在正常機體內，MMPs 可通過分解ECM 來控制其數量，當炎性作用刺激ECM過度表達時，亦會誘導MMPs、TIMPs 表達增多[17]。

有研究[18]發現，大腸桿菌感染絨毛膜后，MMP-2 和MMP-9 活性形態的分泌增加，并與ECM 相 關，而TIMP-1、TIMP-2 和TIMP-4 沒 有變化。牙齦桿菌LPS 和大腸桿菌LPS 處理的細胞中MMP-3mRNA 和蛋白表達顯著上調[19]。以LPS誘導成骨樣細胞MC3T3-E1 模擬牙周炎患者的病理特征，結果證明LPS 能夠誘導MMP-13 表達[20]，說明大腸桿菌和LPS 均可引起組織器官炎癥甚至纖維化。本試驗研究結果顯示，熱滅活的大腸桿菌菌液誘導后，BMECs 中MMP-2、TIMP-1 表達出現不同程度上調，LPS 誘導后BMECs 中也可檢測出MMP-2。該結果與上述文獻的結果相似，但MMP-2、TIMP-1mRNA表達到達峰值的時間不一致。

據文獻[21-22]報道，LPS 刺激系膜細胞后，系膜細胞TIMP-1、TIMP-2mRNA 表達增高，而MMP-2、MMP-9mRNA 表達降低。本試驗研究結果顯示，熱滅活的大腸桿菌菌液誘導后，BMECs中的TIMP-1 表達出現上調，LPS 誘導后BMECs中的TIMP-2 表達量先極顯著上升后極顯著下降。在路軍[23]的研究中，LPS 對TIMP-2 的表達具有抑制作用，LPS 在誘導平滑肌細胞MMP-9、TIMP-1 表達的同時可降低TIMP-2 表達，其作用呈濃度時間依賴性。這與本試驗結果相似，TIMP是MMPs 的內源性抑制劑，特異性抑制MMP 的表達與活性，TIMP-2 表達量下降可能與誘導后期MMPs 表達量下降有關。

LPS 能夠促進牙齦成纖維細胞表達uPA，參與牙周組織的破壞[24]。本試驗結果顯示，LPS 作用組和聯合作用組誘導后，BMECs 中PAI-1 的表達出現不同程度上調，并且隨誘導時間延長，MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 表達量出現下降。uPA與細胞表面受體uPAR 結合，使uPA 濃集于細胞表面，活性形式的uPA 絲氨酸蛋白酶結構域可水解激活纖溶酶原轉變為纖溶酶，纖溶酶可直接降解基質組分或進一步激活金屬蛋白酶降解基質[25]。uPA一方面激活MMPs，引起ECM 降解，另一方面又誘導產生PAI-1，使MMPs 的產生受限。PAI-1 通過調節ECM 的降解和沉積、刺激細胞增殖、調節細胞黏附作用等過程，參與纖維化、腫瘤和心血管疾病等[26-27]的發展。

在大腸桿菌誘導的大鼠肺損傷試驗[28]中，MMP-9mRNA 和蛋白表達均升高；在LPS 誘導小鼠肺損傷試驗[29]中，MMP-2、MMP-9mRNA 和蛋白表達均升高。在轉基因小鼠肺組織中TIMP-1/-2/-3 表達上調，MMP-9 活性降低，從而可能減少ECM 降解，導致肺纖維化[30]。有研究[31]表明，MMP-13 由促炎細胞因子誘導，其表達增加與腫瘤、骨關節炎、類風濕關節炎和牙周病等疾病發生發展相關。MMP-2 和MMP-9 在炎癥早期是具有抗纖維化功能的酶，降解部分過多的ECM，減緩纖維化進程，在炎癥后期又可作為炎癥前介質，促進細胞增生，啟動并加速纖維化進程[32]。

大腸桿菌抗原成分復雜，可分為菌體抗原、鞭毛抗原和表面抗原，后者有抗吞噬和抗補體能力[33]。LPS 是大腸桿菌細胞壁的重要組成部分，是革蘭氏陰性菌重要的毒力因子[34]。本試驗中大腸桿菌作用組MMP-2、MMP-3、TIMP-2和PAI-1mRNA 和蛋白表達量高于LPS 作用組，可能與大腸桿菌其他毒力因子作用有關。LPS 可以通過細胞信號轉導途徑引起動物體內炎癥反應[35]。本試驗中，聯合作用組MMP-1、MMP-9、MMP-13和uPARmRNA 表達量低于菌液作用組和LPS 作用組，可能與BMECs 對LPS 的耐受量有關。據文獻[36]報道，20 μg/mL LPS 在體外直接作用可誘導正常肝細胞發生凋亡。在篩選LPS 刺激BMECs 最佳質量濃度試驗中，10 μg/mL LPS 作用后BMECs 的細胞抑制率下降，說明更高質量濃度的LPS 可能會導致BMECs 損傷。本試驗研究表明，大腸桿菌和LPS 誘導BMECs 的早期，uPA 系統被激活表達，參與了MMPs/TIMPs 的激活與調控，促進了ECM代謝，隨著誘導時間延長，uPA 和uPAR 的表達下降，這可能是因為PAI-1 的顯著升高抑制了uPA 和uPAR 表達，進而抑制了其對MMPs/TIMPs 活化的促進作用，加快纖維化進程，也可能是MMPs/TIMPs 和uPA 系統在奶牛乳腺纖維化中的潛在機制。本試驗為明確大腸桿菌及LPS 誘導的BMECs中MMPs/TIMPs 及uPA 系統對奶牛乳腺纖維化的影響奠定了基礎。