乙肝疫苗接種無應答者免疫因素的研究進展①

趙梅娥 張 慧 甄宏斌 黃煥源 王春霞 謝小冬（蘭州市第一人民醫院，蘭州 730000）

乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的以肝臟炎癥性病變為主的傳染病，可引起多器官損害，在世界范圍內廣泛流行。世界衛生組織全球病毒性肝炎報告顯示，2015年全球范圍內約2.57億人患有慢性HBV感染，約134萬人因乙型病毒性肝炎死亡，且死亡人數逐年增加［1］。預防乙肝病毒感染傳統且有效的策略是接種乙肝疫苗，但健康人群按0、1、6個月常規接種程序接種三劑乙肝疫苗，仍有5%～10%接種者未產生乙肝病毒表面抗體（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）或產生的抗-HBs滴度＜10 U/L而呈無應答狀態［2-4］，還有部分接種者產生的抗-HBs滴度＜100 U/L，在體內持續存在時間較短，呈低應答狀態。既往HBV疫苗無應答相關研究主要集中于疫苗因素、機體自身特征及環境特征、遺傳因素、免疫相關分子特征等方面，本文主要對HBV疫苗接種無應答者的免疫相關遺傳因素及免疫細胞分子特征研究進展進行闡述，旨在為HBV疫苗免疫無應答的機制研究提供理論依據。

1 HBV疫苗誘導抗體形成的機制

目前我國普遍使用的重組HBV表面抗原由于僅含HBsAgS蛋白，免疫原性較弱，必須與免疫佐劑——明礬聯合使用。研究報道，明礬能夠延長抗原在注射部位的存在時間，從而增強抗原提呈細胞攝取提呈能力［5-7］。B淋巴細胞產生抗-HBs的過程依賴于多重信號刺激，注射HBV疫苗后，樹突狀細胞或巨噬細胞被激活，捕獲抗原后遷移至近端淋巴結發育成熟并處理抗原，將HBsAg以肽-MHCⅡ復合物形式呈遞給T細胞，激活CD4+T淋巴細胞，促進其增殖并分泌Th2細胞因子，從而激活B細胞分化，轉化為漿細胞，分泌抗-HBs［8］。另外，BCR也可識別并結合抗原使B細胞共受體［BCR-CD79a/b（BCRIgα/β）和CD19/CD21/CD81］胞內基序ITAM活化，B細胞活化后與Th細胞表面多對共刺激分子（如CD40/CD40L）相互作用，促進Th細胞分泌細胞因子IL-2、IL-4、IL-21、IL-6等，進一步促進B細胞增殖分化為漿細胞并產生抗體或分化為記憶性B細胞［9-10］。

2 HBV疫苗無應答者的免疫因素

2.1 HLA對HBV疫苗免疫應答的影響HLA，即人類白細胞抗原，其基因區域位于6號染色體短臂21.3區域，是3.6 Mb的高度多態性基因區域，含有270多個基因，其中幾乎一半為假基因或非編碼RNA。按編碼分子特性不同，這些基因可分為三類，即HLA-Ⅰ類、HLA-Ⅱ類及HLA-Ⅲ類［11］。其中，HLA-Ⅱ基因負責將外源抗原呈遞給CD4+Th細胞，由于多個HLA-Ⅱ基因變異與HBV疫苗接種、持續性HBV感染和自發性HBV清除有關而備受關注［12-15］。研究發現，HLA在決定疫苗免疫應答強度中起關鍵作用，參與調節嬰幼兒及成人抗-HBs生成［16-18］。JAFARZADEH等［12］分 析 了HLA基 因 與HBV疫苗免疫應答相關性的一系列研究，總結出HLA-Ⅰ類（HLA-A、B、C等）、HLA-Ⅱ類（HLA-DP、DR、DQ等）及HLA-Ⅲ類（c2、c4等）基因中存在調控HBV疫苗免疫應答的基因，但在不同種族人群間不盡相同。幾項全基因組關聯研究顯示，HLA-Ⅱ基因與疫苗應答有關，如位于HLA-DRBI基因上游12 kb的SNP（rs477515）是與中國漢族人群HBV疫苗無/低應答相關的獨立標記及HLA-DR區可能是HBV疫苗誘導免疫的關鍵易感位點［13］；位于與HLA-Ⅱ類區域相鄰的HLA-Ⅲ類基因富集區域中BTNL2基因（rs4248166、P55.51310212）與HBV疫苗應答顯著相關，HLA-Ⅱ類等位基因DQB1*04：01、DPB1*05：01及3種DRB1-DQB1單體型（DRB1*04：05-DQB1*04：01，DRB1*08：03-DQB1*06：01、DRB1*14：06-DQB1*03：01）與日本人群HBV疫苗無/低應答相關［4］。

2.2 輔助/誘導性T淋巴細胞（Th）對HBV疫苗免疫應答的影響

2.2.1 TCR克隆頻率 宋玉國等［19］報道，HBV疫苗無應答組TCR Vβ基因（Vβ2、Vβ8、Vβ9、Vβ11和Vβ17）單克隆改變頻率明顯低于有應答組，而無應答者CD4+T細胞Vβ5S2-3基因單克隆改變頻率高于應答者，且TCRVβ基因對HBsAg的反應具有個體特異性。

2.2.2 Th1/Th2細胞的分子差異Th1/Th2細胞的細胞因子差異可影響Th1/Th2平衡，最終控制疫苗接種應答差異［20］。正常情況下，各亞群相互促進、相互拮抗處于平衡狀態［21-22］。研究提示，HBV疫苗無應答者HBsAg特異性Th1細胞缺少，或T細胞雖存在對HBsAg具有特異性的TCR但對HBsAg肽-MHC復合物無反應［23-25］；Th1和/或Th2細胞產生的細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β、IL-4缺乏而TGF-β增多［25-27］。此外，CD4+Th細胞介導的免疫應答需一些共刺激分子協同刺激才能充分啟動，研究顯示，乙肝疫苗無應答者共刺激分子CD25、CD69、CD25/CTLA4、CD80/CD86、CD40/CD40L、CD54及其配體LFA-1（ITGAL和ITGB）、CD58和CD2表達降低［28-31］。

2.2.3 濾泡輔助T細胞（Tfh）對HBV疫苗免疫應答的影響Tfh主要分泌轉錄因子B細胞淋巴瘤6（Bcl-6）、IL-21和IL-6受體（IL-6R），通過控制生發中心形成和細胞增殖分化在B細胞分化為漿細胞、產生抗體和Ig類別轉換中發揮重要作用，是輔助B細胞應答的關鍵細胞，在體液免疫中起重要作用［21-22］。Tfh高表達CD44、CXCR5、ICOS、PD1、Bcl-6、IL-21、IL-6R，低表達CD62L、CCR7、PSGL1，Tfh發育依賴于IL-6、IL-21和信號轉導轉錄激活因子3（STAT3），而不依賴于其他已知對Th1、Th2或Th17細胞分化很重要的細胞因子或轉錄因子［22］。Tfh與HBV疫苗免疫應答的相關報道較少。研究報道，HBV疫苗強應答組Tfh表達ICOS增強和IL-21分泌增多［32］；慢性HBV患者外周血CD4+CXCR5+Tfh頻率顯著增高［33-34］；IL-21可增強HBV特異性CD8+T細胞的抗病毒作用，促使HBV病毒清除和HBeAg/抗HBe血清學轉換［35-36］，提示Tfh在抗HBV感染免疫應答中起重要作用。

2.3 Treg在HBV疫苗免疫無應答中的特征Treg主要在機體免疫系統中發揮負向調節作用，對效應細胞增殖、免疫活性發揮起抑制作用。SAKAGUCHI等［37］將Treg的功能歸納為免疫無能性和免疫抑制性。Treg不僅抑制CD8+T細胞增殖，且抑制其分泌細胞因子及殺傷靶細胞效應。研究發現，Treg分泌TGF-β作用于CD8+效應T細胞表面的Ⅱ型TGF-β受體，引起免疫抑制，同時，分泌的IL-10可抑制Th1和Th2細胞合成IL-2等細胞因子［38-39］。濾泡調節性T細胞（follicular regulatory T cells，Tfr）是一類專門在生發中心調控GCB和Tfh細胞應答的CD4+T細胞，來源于常規Treg，并同時兼具Tfh細胞表型特征（FOXP3+BCL6+CXCR5+Tfr）。葉麗林團隊鑒定了mTORC1信號可在Treg磷酸化轉錄因子STAT3，磷酸化后的STAT3啟動轉錄因子TCF-1生成，最終促進轉錄因子Bcl-6產生，從而推動Treg向Tfr分化，并最終通過調控生發中心反應調節抗體生成［40］。但Treg在HBV疫苗無應答反應中的具體機制尚未明確。研究報道，HBV疫苗低/無應答者體內存在Treg過度表達，但這些Treg是否具有HBsAg特異性及如何引起機體對疫苗低反應需進一步研究［41］。楊燕等［42］研究發現，HBV疫苗無應答者外周血Treg PD-1表達顯著高于應答者，提示Treg可能通過PD-1/PD-L1途經發揮抑制效應。

2.4 B細胞功能障礙對HBV疫苗免疫應答的影響B細胞不僅能通過產生抗體發揮特異性體液免疫功能，也是重要的抗原提呈細胞參與免疫調節。另外，B細胞還表達多種含有ITIM的受體，這些受體招募負調節磷酸酶（如SHIP1和SHP1），抑制BCR信號［9-10］。VALATS等［43］研究發現，應答者分泌IgG型抗HBsAg抗體的細胞數明顯多于無應答者，但體外實驗發現來自應答者和無應答者的B淋巴細胞獲得漿細胞表型的能力相同。SALIMZADEH等［44］研究發現，急、慢性HBV感染者體內存在一類功能障礙的HBsAg特異性B細胞，其特征為CD21和CD27低表達，但抑制性標志物如PD-1和轉錄因子T-bet卻高表達。HBV疫苗低應答者體內是否也存在功能障礙的B細胞仍需要更深入的依據。

2.5 樹突狀細胞對HBV疫苗免疫無應答的作用 VERKADE等［45］在對慢性腎病患者接種HBV疫苗后的無應答者進行研究時發現，無應答者體內重要的抗原提呈細胞——單核細胞來源樹突狀細胞（monocyte-derived dendritic cells，moDC）的成熟活化標志MHCⅡ和CD83分子表達顯著低于應答者，低活化的moDC影響抗原提呈，同時moDC刺激抗原特異性T細胞的能力也較應答者下降，導致機體對HBV抗原的低反應性。而采用GM-CSF與乙肝抗原共同注射對HBV疫苗低應答的B10.M小鼠，GM-CSF可通過募集和激活樹突狀細胞使小鼠產生高水平乙肝抗體，從另一方面證實HBV疫苗無應答中樹突狀細胞發揮重要作用［46］。

2.6 CD8+T細胞在HBV疫苗免疫無應答中的免疫特征HBV疫苗不僅可引起體液免疫應答，也會引起細胞免疫應答。CD8+T細胞通常稱為細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），主要通過兩種途徑發揮細胞免疫功能，一種途徑是通過釋放細胞毒素，如穿孔素、顆粒酶及顆粒溶解素誘發細胞凋亡信號，另一種途徑是通過CTL表面的FAS配體與目標細胞FAS受體結合誘發細胞凋亡信號［47］。病毒特異性長壽CD8+T細胞在一些抗病毒疫苗（如黃熱病毒、登革熱病毒）引起的免疫應答中扮演重要角色［48］，而有關HBV疫苗無應答者CD8+T細胞的研究較少。WATANABE等［49］報道，CD8+T細胞影響無應答者接種HBV疫苗后T細胞增殖并在HLABw54-DR4-DRw53-DQw4單體型決定的個體乙肝疫苗無應答中發揮作用。NOWICKI等［50］發現無應答者CD8+T淋巴細胞數顯著增多，而VINGERHOETS等［51］發現CD8+T淋巴細胞未參與無應答過程。

3 小結與展望

綜上，機體通過復雜的免疫網絡系統正向和負向調節機制限定抗原刺激產生的免疫應答強度、范圍、作用程度及持續時間。國內外學者分別從機體各類免疫細胞數量、細胞因子分泌、分子表達水平等方面與HBV疫苗免疫應答強度的相關性進行了大量研究，為研究HBV疫苗無應答機制提供了科學依據。但各研究采取的實驗技術、方法、方案和研究對象及數量不同，各類免疫細胞及其亞群在HBV疫苗免疫無應答中發揮的作用仍存在爭議，并缺乏深層次的功能性研究，HBV疫苗免疫無應答的分子機制仍是疫苗領域的空白。因此隨著分子生物學技術，如高通量測序技術、單細胞測序技術的發展，為進一步闡明HBV疫苗免疫無應答的分子遺傳機制及開發更有效的HBV疫苗，有必要在多組學領域對HBV疫苗免疫無應答的機制進行多中心大樣本量聯合研究，并對相關分子進行功能驗證。