針刺手法對自發性高血壓大鼠胸主動脈BKCa離子通道細胞電生理的調控研究*

王 洋 ，張麗麗 ，趙孟雄 ，杜 凱 ，沈 燕 ，5，韓 林 ，申鵬飛 ，王 舒 ，5

（1．天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸科，天津 300193；2．國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193；3．天津中醫藥大學，天津301617；4．天津市針灸學重點實驗室，天津 300193；5．天津市針灸研究所，天津 300193）

高血壓是以體循環動脈壓升高為特征的臨床綜合征，動脈和小動脈血管平滑肌張力是血管阻力和高血壓的決定因素[1]。血管平滑肌的鉀離子通道可通過調節膜電位來決定血管張力：鉀離子通道激活可導致膜超級化，引起血管舒張；抑制鉀離子通道導致膜去極化，引起血管收縮[2]。大電導鈣激活鉀通道（BKCa）在血管平滑肌上表達密度最高，其因電導大、電壓依賴性強和鈣離子依賴性高區別于其他離子通道，在高血壓中發揮著重要的調節作用[3-4]。本研究采用“活血散風”針刺法干預自發性高血壓動物模型，以針刺效應的重要影響因素——針刺手法為切入點，觀察針刺手法對BKCa通道電生理特性的影響，從離子通道角度為針刺降壓提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 24只健康雄性自發性高血壓大鼠，16周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2007-0001。實驗大鼠按照隨機數字表法分為模型組、針刺手法組、針刺無手法組，每組8只；同等周齡健康雄性WKY大鼠8只，作為正常對照組。實驗室溫度20～25℃，濕度 40%～50%，光照時間 7∶00-19∶00。自由攝食、飲水。所有動物的處置符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑：DMEM細胞培養基、胎牛血清（Gibco，美國），N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）（Santa Cruz，美國），DMSO、氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣（Sigma，美國）等。

1.3 主要儀器：膜片鉗放大器（EPC-10，HEKA，德國），數據采集軟件 Patchmaster（Patchmaster，HEKA，德國），數據分析軟件（HEKA，德國），程控玻璃微電極拉制儀（P-97，Sutte Instruments，美國），微電極操縱器（MP-285，Sutter Instruments，美國），顯微鏡（LX71，Olympus，日本），倒置顯微鏡（Nikon Ti-S，日本）等。

1.4 治療方法 參考中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”，并根據課題組前期研究大鼠人迎穴定位[5]，實驗選擇大鼠兩側下頜骨隅突連線下（8．0±0．3）mm，前正中線旁（5．5±0．4）mm。

針具選用蘇州醫療用品廠生產的“華佗牌”毫針，長25 mm，直徑0．20 mm。針刺手法組針刺深度5 mm，施用小幅度（＜90°）、頻率 120次/min的手法1 min，留針15 min；無手法組針刺后不施用手法，留針 15 min；每日上午 8∶00-9∶00 進行干預，5 次/周，共4周；正常對照組和模型組不進行針刺，但每天在同一時間段使用與針刺手法組相同的方法抓取和固定。

1.5 觀察指標及檢測方法 1）血壓測量：使用日本Softron無創血壓儀進行鼠尾血壓測量。在室溫（22±2）℃條件下，測量大鼠安靜、清醒狀態鼠尾血壓，連續測量3次，取平均值。測量干預前、干預1、2、3及4周的收縮壓和舒張壓。2）BKCa離子通道功能檢測：細胞培養：大鼠腹腔注射25%烏拉坦0．75 g/kg，麻醉。頸椎離斷，75%乙醇消毒腹部皮膚，剪開腹腔至胸腔，取下胸主動脈至主動脈弓，放入冰的HBSS中，顯微鏡下去除主動脈周圍的殘存脂肪和軟組織，胸主動脈放入消化液中，37℃、5%CO2消化30 min（目的分離內膜和外膜）。顯微鏡下剝離外膜，將去除外膜層的主動脈轉移至37℃預熱的DMEM完全培養基中，37℃、5%CO2孵育3 h；將主動脈剪成1～2 mm寬的環狀組織，轉移到培養皿的主動脈消化液中，37℃、5%CO2消化2 h，在此期間，間歇性用吸管吹打組織，使酶與組織保持充分接觸。在消化液中加入5 mL 37℃預熱細胞培養液終止消化液，將所有細胞及液體轉移至15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min。棄上清，加入適量體積的新細胞培養液，將細胞接種于明膠包被的細胞培養板或細胞爬片中，48 h后用于膜片鉗檢測。

電生理記錄：顯微鏡下，用入液電阻在3～5 MΩ的電極封接細胞，形成G歐姆封接后，抬起電極撕掉細胞膜，形成在內面向外記錄模式。記錄單通道BKCa電流，實驗數據由EPC-10放大器（HEKA）進行采集并存儲于PatchMaster（HEKA）。采用1～5 kHz濾波，數字采樣頻率20 kHz，所有實驗操作在室溫22～25℃下進行。數據分析采用Fitmaster軟件進行，開放概率用NPo表示，N表示單個通道的數量，Po表示單個通道的開放概率，使用以下公式計算：NPo：Ao表示關閉狀態的振幅柱狀圖曲線下的區域，A1-An表示1-n個通道的不同開放狀態電流水平的柱狀圖區域。

1.6 統計學處理 應用SPSS 23．0軟件進行數據分析，計量資料的描述用均數±標準差（）表示，不同時點血壓比較采用重復測量的方差分析，相同時點組間血壓、離子通道開放時間和開放概率均數比較采用單因素方差分析，各個實驗組之間的兩兩比較采用LSD法，P＜0．05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓水平比較 模型組、針刺手法組、無手法組的收縮壓和舒張壓均明顯高于正常對照組（P＜0．05），針刺手法組在治療 1、2、3、4 周血壓值顯著低于模型組（P＜0．05），無手法組在治療 1周時收縮壓和舒張壓均低于模型組（P＜0．05），在治療2和 3 周時收縮壓低于模型組（P＜0．05）；針刺手法組與無手法組比較，尚未發現有統計學差異（P＞0．05）。5次血壓測量時點間、不同分組間均有統計學差異（P＜0．05），分組與測量間有交互作用（P<0．05）。見圖 1。

2.2 各組大鼠主動脈BKCa通道電流、電導的比較 正常對照組和模型組BKCa通道電流幅度隨超極化程度加大而增大，在相同鉗制電壓下，通道電流幅度無統計學差異（圖2A、2B）。與模型組比較，針刺手法組、無手法組可增強BKCa通道電流幅度，但差異均無統計學意義（圖2C、2D）。由電流-電壓關系曲線（IV曲線）的斜率得出所記錄的單通道電導均值為 291．3 pS（膜片數=8）（圖 2E、2F）。不同鉗制電壓下，各組 BKCa通道的電流無明顯改變（P＞0．05）。

圖1 4組大鼠不同時點血壓水平比較（，n=8）Fig.1 Level of blood pressure at different time in the four groups（，n=8）

2.3 各組電流在+40 mV時開放時間、開放概率的比較 見圖3，模型組開放概率明顯低于正常對照組（P＜0．05），針刺手法組的開放概率高于模型組（P＜0．05）；無手法組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。在開放時間方面，模型組低于正常對照組（P＜0．05），而針刺手法組、無手法組與模型組比較，均無統計學差異（P＞0．05）。

3 討論

高血壓血管平滑肌張力變化與膜電位密切相關，離子通道是影響膜電位的重要因素。血管平滑肌上存在著5種鉀通道：電壓依賴性鉀通道、BKCa、內向整流鉀通道、三磷酸腺苷（ATP）敏感性鉀通道及串聯雙孔鉀通道[2]。其中BKCa通道具有電導大、對鈣離子（Ca2+）敏感性高、電壓依賴性強的特點，通過Ca2+和膜電位這兩種細胞信號，反饋調節細胞內離子平衡及細胞興奮性[6]。BKCa通道表達減少、失活或阻滯可導致血管收縮，血壓升高，如BKCa通道的特異性阻滯劑阻斷BKCa后冠狀動脈壓力劇烈升高[7]；BKCa通道激活劑可解決動脈壓力增高問題。因此，BKCa通道的研究為預防和治療高血壓提供了新的靶點。

圖2 各組單通道膜BKCa電流記錄及IV曲線Fig.2 Record of single-channel membrane BKCa current and IV curve

圖3 各組單通道膜BKCa開放概率、開放時間（，n=8）Fig.3 Single-channel membrane BKCa opening probability and opening time（，n=8）

研究采用單通道膜內面向外模式記錄BKCa的變化，發現模型組與正常對照組胸主動脈平滑肌BKCa在相同鉗制電壓下電流無明顯差異。本研究還發現與正常對照組大鼠相比，模型組胸主動脈平滑肌細胞BKCa通道的開放時間和開放概率降低，而人迎穴施用針刺手法可提高該通道的開放概率，而不施用針刺手法對其開放概率無明顯影響。目前關于高血壓大鼠不同組織平滑肌BKCa通道研究結果如下：有研究發現12周齡自發性高血壓大鼠的腸系膜動脈平滑肌BKCa電流增強、開放概率增加[8-9]；高鹽飲食所致高血壓大鼠血管平滑肌細胞膜BKCa電流隨高鹽飲食時間的延長而增大[10]；LIU等[11]應用全細胞膜片鉗發現12～16周齡模型組大鼠腦血管平滑肌細胞電流增強，而單細胞膜片鉗技術發現與正常對照組比較，模型組在不同膜電位下的BKCa電流、電導無明顯變化。研究發現BKCa通道與年齡相關，隨著月齡的增加，高血壓大鼠BKCa通道的開放時間、開放概率、瞬時外向電流幅度及頻率明顯降低[12]。因此推測高血壓早期機體血液動力學存在一定的自我調節與代償，而后期可能出現失代償，BKCa通道功能與表達變化可能是機體為適應血液動力學變化而進行的自我調節。

石學敏院士認為，高血壓的病機是氣血脈失司，創立了“活血散風”針刺法，近年來廣泛應用于高血壓的治療，效果顯著。人迎穴是“活血散風”針刺法的主穴，是氣海的“營運之輸”。氣海理論認為，血液在脈管中運行不息，流布于全身，環周不休，自成體系，因此氣海最基本的物質結構和基礎是氣、血、脈：氣推動血液在脈內運行，形成血壓。針刺人迎穴可調理氣海、通利血脈，長期的針灸臨床研究證實，對人迎穴施以適當的手法或刺激，降壓效果明顯[13-14]。

捻轉、提插是最基本的針刺手法，足夠、有效的刺激量是獲得療效的關鍵[15]。針刺手法是產生針刺效應的重要影響因素，研究發現，針刺刺激產生組織移位達100 μm[16]，組織的移動會刺激細胞中胞質Ca2+增多，Ca2+振幅增大、存儲，導致體內血漿中Ca2+和內啡肽的釋放[17]。其中Ca2+通道是細胞內最主要的反應通道。而BKCa通道激活與胞內Ca2+濃度及肌漿網鈣火花偶聯有關[18]。針刺如何調節BKCa通道達到降壓的機制還需進行深入研究。